R - Teses de Doutoramento / Doctoral Theses
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- Bioactive compounds from nannochloropsis oculata grown under modulated stress : from production to validationPublication . Sousa, Sérgio Daniel da Cruz e; Gomes, Ana Maria Pereira; Carvalho, Ana Paula Taboada da Costa SantosNannochloropsis oculata is a microalga widely recognized as a potential source of polyunsaturated fatty acids, namely the omega-3 eicosapentaenoic acid (EPA), which beneficial health effects have been demonstrated. In order to maximize the EPA amount that may be obtained from a culture, different strategies may be pursued, such as increasing the microalgas’ biomass EPA content and the efficiency of its extraction process. Based on the above rationale, the main goal of the current thesis was to apply different stress conditions to N. oculata culture, which would increase EPA content, but without hindering growth. The strategy employed entailed the application of stress in a modulated sinusoidal fashion, to stimulate the response, although providing the microalga the possibility to adapt and not cease its growth. Two abiotic factors were independently utilized (temperature and light intensity), and conditions were alternated between optimum and stress levels, in multiday cycles. The factors were applied at lower-than-optimum values (5 and 10 ºC; 30 and 50 μmol photons/m2/s for temperature and light intensity, respectively), and it was found that the approach was successful at achieving the desired goals. While temperature stress (10 ºC) presented the best results, with an 158% EPA content increase, light intensity (30 μmol photons/m2/s) also increased EPA content significantly by 126%. Moreover, the increases in EPA content originated from individual cells contents and not just from overall biomass increase, and these were obtained in a relatively short period of time, which is of utmost importance regarding its industrial viability. Eicosapentaenoic acid is conventionally extracted with hazardous organic solvents. Therefore, an additional line of research was undertaken, aiming at extracting EPA by using less hazardous solvent mixtures (SM), namely hexane:isopropanol (Hxn:2-PrOH; 3:2) and diethyl ether:ethanol (Et2O:EtOH; 2:1). The use of alternative technologies, namely high hydrostatic pressure (HHP) and moderate electric fields (MEF), was also assessed as adjuvants to increase the extraction efficiency of the SM. Concerning SM, Et2O:EtOH was able to increase 1.3-fold the EPA yield of the conventional Folch SM. Regarding the technologies, neither increased extraction yields when used independently; however their sequential combination was able to increase EPA yield by 162%. When associated, Et2O:EtOH and the combined technologies (HHP - 200 MPa, 21 °C, 15 min – followed by MEF processing at 40 °C, 15 min) enabled to extract higher amounts of EPA from N. oculata wet biomass, which is extremely relevant for the industries as no expensive drying step is required. Moreover, it is of dire importance to provide such alternatives to the “classical” extraction processes and solvents, as the industries require higher yields and lower environmental impact in their downstream processing. Since the biological potential of a microalga (or an extract thereof) is intrinsically dependent on its composition, the impact of the stress modulation and the SM utilized for extraction of lipid fraction were studied by characterization and assessment of biochemical and biological activities. Concerning the lipid extracts, it was revealed that the one obtained from the stressed culture presented the best results, namely in terms of anti-steatosis (hepatic lipid accumulation < 8% than that of steatosis-induced cells) and anti-inflammatory activities (decreased expression of interleukine (IL)-6, IL-10, and interferon- in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages). Moreover, both extracts presented oxygen radical absorbance capacity (within the range of 49- 50 μmolTrolox equivalent/mgextract), no metabolic inhibition of several cell lines (Caco-2, HT29-MTXE12, Hep G2, 3T3-L1, and RAW 264.7), and inhibition of triacylglycerols hepatic accumulation (glycerol release ca. 2-fold higher than in non-treated cells). Overall, the results showed that the modulated stress did indeed enhance the potential beneficial effects of the N. oculata lipid extracts on human health, as well as maintain their safety. Once the lipid fraction was extracted from the stressed culture, remaining biomass may still contain other compounds with interesting biological activities. Hence, by applying a biorefinery concept, the defatted biomass was enzymatically hydrolyzed with cellulase Celusoft Supreme for 3 h, followed by the protease NewPro, for 6 h, both at 53 ºC, after which the soluble fraction of hydrolysate (SFH) was characterized in terms of peptide and polysaccharide profiles, and assessed regarding its biochemical and biological activities. The results showed that the defatted biomass may still be utilized as a resource, since the SFH presented antioxidant capacity (3.2 μmolTrolox equivalent/mgFDB), antidiabetic (19.4% inhibition of α-glucosidase) and immunosuppression potential (NO production by LPS-stimulated Raw 264.7 cells decreased to < 10% that of the control), anti-inflammatory activity (decreased expression of IL-6, IL-8 and tumor necrosis factor-α by Caco-2 cells in LPS-induced inflammation) and antimicrobial activity, particularly against Gram-positive bacteria. In conclusion, it was demonstrated how modulated stress may enhance the production of bioactive compounds from N. oculata (specifically EPA) and new strategies to efficiently extract them were identified, as well as their biological potential was unveiled. The strategies presented herein for production of N. oculata with increased EPA content, and extraction thereof, may constitute solutions for the food and nutraceutical industries, allowing them to obtain EPA faster and with higher yields, concomitantly decreasing the process environmental impact. Ultimately, that will increase the economic viability of obtaining EPA from N. oculata.
- Effect of high-pressure as a non-thermal pasteurisation technology for raw ewes' milk and cheese safety and quality : case study on Serra da Estrela cheesePublication . Inácio, Ana Rita Santos; Gomes, Ana Maria Pereira; Saraiva, Jorge Manuel AlexandreO queijo Serra da Estrelaé um queijo tradicional produzido a partir de leite de ovelha cru, altamente reconhecido e referenciado, com um período de maturação de 45 dias, sendo posteriormente comercializado sob refrigeração. Sendo um queijo de leite cru, alterações nos parâmetros microbiológicos podem dificultar o armazenamento prolongado. O principal objetivo desta tese de doutoramento foi avaliar a possível contribuição que o processamento de alta pressão (AP), como uma tecnologia de pasteurização a frio, pode ter para melhorar asegurança microbiológica, mantendo a qualidade físico-química e sensorial (45 dias de maturação) durante armazenamento prolongado a 4 ºC. Uma vez estabelecidas a complexidade das relações entre os parâmetros de AP e o queijo, um segundo objetivo foi testar se a aplicação de AP para pré-tratar o leite de ovelha cru, isoladamente ou em combinação com o tratamento com AP dos queijos maturados resultantes poderia melhorar ainda mais a segurança microbiológica sem comprometer os seus atributos únicos de texturae sabor. Para tal, queijos com 45 dias de maturação foram submetidos a AP a 600 MPa/6 min (P1), 450 MPa/6 min (P2) e 450 MPa/9 min (P3). A contagem de células viáveis de lactococos, lactobacilos, enterococos e microrganismos mesófilos totais foram reduzidas em cerca de 4 log ufc/g nos queijos P1 e em 2 log ufc/g nos queijos P2 e P3, comparativamente aos queijos controlo (não processados, ChC). As contagens deEnterobacteriaceaee Pseudomonas spp. mostraram reduções >5 e >4 ciclos logarítmicos, respetivamente, para números abaixo do limite de quantificação durante o armazenamento. De uma forma geral, os índices proteolíticos foram mais baixos nos queijos AP do que nos ChC. Os queijos submetidos à AP nas condições P1 mantiveram o índice de extensão de maturação ao longo dos 15 meses de armazenamento (27-30%) próximo do valor quantificado para o ChCaos 45 dias de maturação (29%), mantendo a textura característica, mas foram considerados mais duros que o ChCdo ponto de vista sensorial. O tratamento AP não causou grandes alterações nem no perfil lipídico do queijo Serra da Estrela(conteúdo total de triglicerídeos (65-66 TG/100 g) e de ácidos gordos) nem nas propriedades nutricionais (índices de aterogenicidade e trombogenicidade similares; ~2,3 e ~2,6, respetivamente). Um estudo complementar foi realizado para análise comparativa de dois sistemas de embalamentono embranquecimento da crosta do queijo: embrulhado em papel sem vácuo (P) e embalado a vácuo em plástico (V), na qualidade de queijos Serra da Estrelapreviamente pasteurizados por AP a 525 MPa/6 min. Queijos controle (ChC) e queijos AP (ChP) foram embalados nesses dois sistemas (ChC+V; ChC+P; ChP+V e ChP+P) e foram conservados sob refrigeração durante 10 meses. Os queijos ChP+V e ResumoIVChP+P continham um número de células viáveis de lactococos, lactobacilos, enterococos e mesófilos totais mais baixo do que os queijos ChC+V e ChC+P, i.e. entre 4 e 6 log ufc/gvs aprox. 6 log ufc/g, respetivamente. Osbolores e leveduras (>5 log ufc/g) proliferaram nos queijos embrulhados em papel. Os queijos ChP+V revelaram um índice de extensão de maturação constante ao longo dos 10 meses de conservação, com valores próximos aos quantificados para queijos ChC+V aos 0meses. Sistema de embalamento em papel pode ser adequado para curtos períodos de conservação, enquanto o sistema a vácuo é preferível para longos períodos. A aplicação de AP ao leite de ovelha cru como pré-tratamento antes da produção de queijo pode levara um aumento no rendimento do queijo e incremento da qualidade. Inicialmente, foi realizado um amplo desenho experimental (200–400 MPa; 5–30 min; 1–48 h de tempo de espera antes da AP; 1–24 h após AP), e os resultados alcançados permitiram identificar quea intensidade da pressão, o tempo sob pressão e o tempo de espera após AP foram os fatores mais importantes. A aplicação do modelo de superfície de resposta (100-300 MPa; 5-30 minutos, 24 horas antes e após AP), visando uma redução tão pequena quanto possível do número de células viáveis de lactococos, lactobacilos e enterococos, permitiu identificar como condições ideais de AP o tratamento de leite a 121 MPa/30 min. O modelo foi validado e um estudo de aumento de escala foi realizado em queijaria, resultando num incremento do rendimento em 10,4% com o leite pré-tratado (MP) por AP em comparação com o queijo produzido com leite não tratado (MC). O leite pré-tratado por AP revelou insignificantes reduções da carga microbiológica no leite e coalhada. Aos 60 dias de maturação, metade dos queijos produzidos com MPe MCforam tratados com AP a 525 MPa/6 min (MP+ChP e MC+ChP, respetivamente) e a outra metade permaneceu como controlo (MP+ChCand MC+ChC, respetivamente). Todos os queijos foram conservados sob refrigeração por 5 meses. A aplicação de AP em queijos maturados causou similares reduções da carga microbiológica às obtidas nos estudos anteriores (1-3 reduções logarítmicas para bactérias ácido lácticas, e abaixo do limite de quantificação para bolores e leveduras, Enterobacteriaceaee Pseudomonassp.). O pré-tratamento com AP levou ao aumento do índice extensão de maturação, enquanto o tratamento AP no queijo manteve o mesmo. O pré-tratamento AP no leite parece melhorar as propriedades tecnológicas do queijo,enquanto a aplicação AP aos queijos maturados pode aumentar a segurança do queijo; o acoplamento de ambas manteve ascaracterísticas inalteradas e, poderá contribuir positivamente para a melhor promoção deste queijo juntodos produtores e consumidores.
- Evaluation of possible risks of antibiotic resistance transmission to humans by wastewater-irrigated cropsPublication . Scaccia, Nazareno; Rodrigues, Célia Maria Manaia; Moreira, Ivone Cristina VazA reutilização de águas residuais tratadas tem sido incentivada em todo o mundo, em particular para irrigação agrícola, porque pode ser uma fonte de água confiável e importante, principalmente em países sob estresse hídrico. Ainda se sabe pouco sobre os riscos associados à utilização de águas residuais tratadas, designadamente no que se refere à disseminação de bactérias resistentes a antibióticos (ARB) e genes de resistência a antibióticos (ARGs). Uma das principais consequências da disseminação através da irrigação agrícola utilizando águas residuais tratadas é a contaminação da cadeia alimentar humana. Atualmente, o conhecimento sobre a transmissão de ARB e ARGs para seres humanos a partir de fontes ambientais é escasso. No entanto, a reutilização de águas residuais surge como uma fonte potencial de transmissão direta ou indireta, principalmente através da cadeia alimentar humana. Esta tese explorou estas questões com base em pesquisa bibliográfica e em abordagens experimentais. O estudo foi planeado com o objetivo de inferir se as bactérias que sobrevivem nas águas residuais serão capazes de colonizar as plantas e se ARB isoladas de águas residuais e os respectivos ARGs poderiam persistir na presença da microbiota fecal autóctone de um indivíduo saudável. As hipóteses propostas para este trabalho foram as de que: 1) ARB e ARGs isoladas de águas residuais tratadas podem colonizar plantas e, eventualmente, estabelecer-se como endófitos; 2) ARGs de ARB isoladas de água residual tratada podem persistir na presença da microbiota fecal de um humano saudável. O argumento que suporta esta duas hipóteses é o de que, se ingeridas através de vegetais, as ARB e ARGs poderiam persistir no intestino humano. Utilizaram-se três abordagens principais para testar as hipóteses referidas: a) foi realizada pesquisa bibliográfica com termos de busca relacionados com bactérias endófitas, filtrada para variedades agrícolas edíveis e normalmente consumidas cruas, e que pertencessem a grupos bacterianos também reportados em águas residuais e no microbioma humano; b) analisou-se a presença de ARB e ARGs em isolados bacterianos em vegetais edíveis (agrião e morango prontos para consumo); e c) foi avaliada a persistência de ARGs transportados por ARB isoladas de efluentes na presença de microbiota fecal de uma criança saudável. A investigação baseada na literatura teve como objetivo explorar a diversidade de bactérias endofíticas associadas a diferentes habitats (plantas, águas residuais e microbioma Resumo x humano) e inferir a probabilidade de que as ARB e ARGs possam ser transferidos das águas residuais para as plantas e depois para os seres humanos (Capítulo 3). Este estudo bibliográfico permitiu compilar uma lista de bactérias endofíticas distribuídas por mais de 20 filos reportadas em mais de 45 variedades de vegetais. Como o estudo procurava explorar as possíveis vias de transmissão para humanos, a lista de espécies agrícolas encontradas na literatura foi reduzida apenas a plantas que podem ser consumidas cruas, como sejam alface, cenoura, rabanete, pepino e tomate. Com o objetivo de avaliar a probabilidade dessas plantas captarem bactérias que podem atuar como vetores de resistência a antibióticos, a presença dos grupos bacterianos identificados como endófitos foi também investigada em comunidades microbianas de águas residuais e em microbiomas humanos. Para grupos bacterianos, cuja ocorrência foi relatada nos três tipos de ambiente, endófitos de plantas edíveis/cruas, águas residuais e microbioma humano, foi realizada uma análise exploratória com base em literatura e bases de dados públicas, de genes de resistência a antibióticos e de virulência. Este estudo sugere que bactérias relacionadas com géneros como Enterobacter, Acinetobacter, Pseudomonas e Staphylococcus, cuja relação taxonómica com agentes patogénicos oportunistas e portadores de resistência a antibióticos, é conhecida, podem ser encontrados como endófitos em variedades agrícolas comestíveis, sugerindo que podem ser veiculados por águas residuais e ser transmitidos para o microbioma humano. Esses resultados sustentam a hipótese de que as bactérias transportadas pelas águas residuais, com propriedades fisiológicas e ecológicas semelhantes a bactérias endófitas, podem ser captadas por variedades agrícolas edíveis e, assim, se ingeridas, podem eventualmente colonizar o corpo humano. Deste modo, sugere-se que a irrigação com águas residuais pode aumentar os riscos de transmissão de bactérias clinicamente relevantes do meio ambiente para os seres humanos, através da cadeia alimentar. Com recurso a métodos dependentes da cultura, avaliou-se a diversidade de bactérias cultiváveis e resistentes a antibióticos que podem ser encontradas em associação com variedades edíveis, especificamente o agrião e morangos prontos para o consumo (capítulo 4). Os agriões prontos para consumo foram adquiridos em supermercados locais, enquanto as amostras de morangos foram colhidas ao longo de uma cadeia de processamento de frutas de uma empresa que produz preparados de frutas para a indústria alimentar. Estudou-se a fração microbiana das folhas de agrião e as bactérias associadas ao morango (comunidade epífita e endofítica). Os isolados de agrião (n = 68) e morango (n = 52) foram caracterizados fenotipicamente de acordo com seu perfil de resistência a antibióticos. Destes, selecionou-se uma coleção de isolados que exibia fenótipo de resistência a pelo menos três classes de Resumo xi antibióticos, para identificação com base na análise da sequência do gene 16S rRNA e caracterização por reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional, quanto à presença do gene da integrase de intregrões de classe 1, intl1, os ARGs sul1, blaTEM, blaCTX-M, blaOXA-A e blaSHV, e os grupos de incompatibilidade de plasmídeos com base nos tipos de origem de replicação FIA, FIB, FIC, HI1, HI2, I1-Iγ, L/M, N, P, W, T, A/C, K, B/O, X, Y, F, e FIIA. Além disso, testou-se se as bactérias isoladas de morango e agrião poderiam adquirir ARGs por transformação. Observou-se que o agrião pronto a consumir apresentava contagens de heterotróficos totais na ordem de 3,5 x 107 ± 4,9 x 107 CFU/mL e 5,4 x 105 ± 6,2 x 104 CFU/mL de solução de lavagem de agrião para os supermercados A e B, respectivamente, enquanto o morango processado apresentava contagens de bactérias cultiváveis na ordem de 9,1 x 105 ± 1,8 x 105 CFU/g de peso seco de morango, com alguns dos isolados a apresentarem fenótipos de resistência a antibióticos. Algumas destas bactérias foram identificadas como membros dos géneros Pseudomonas, Stenotrophomonas, Erwinia, Rahnella, Methylobacterium e Chryseobacterium. Alguns destes grupos bacterianos foram anteriormente identificados com endófitos e géneros como Pseudomonas e Stenotrophomonas estão proximamente relacionados com patogénicos oportunistas que podem ser transportadores de ARGs adquiridos. A pesquisa de ARGs, intI1 e grupos de incomatibilidade de plasmídeos revelou que estes elementos genéticos foram encontrados numa pequena fração das bactérias analisadas (2 isolados). Além disso, resultados preliminares sugeriram que os isolados de agrião e morango podem ser suscetíveis a adquirir resistência a antibióticos e, assim, estar envolvidos na disseminação da resistência a antibióticos. O terceiro estudo baseou-se no argumento de que bactérias de águas residuais ou os seus ARGs poderiam ser rapidamente eliminados em presença da complexa comunidade da microbiota fecal. Este estudo foi realizado em ensaios de microcosmo com material fecal (FMAs) inoculado com bactérias isoladas de água residual, portadoras de genes de resistência a antibióticos conhecidos (Capítulo 5). Os isolados de águas residuais inoculados foram Escherichia coli (estirpe A2FCC14) e Enterococcus faecium (estirpe H1EV10), portadores dos ARGs blaTEM, blaCTX, blaOXA-A e vanA, respectivamente. O efeito de condições como a presença ou ausência de oxigénio ou os antibióticos cefotaxima ou vancomicina, na composição da comunidade microbiana do material fecal e na persistência dos ARGs exógenos foram investigados. Os FMAs foram monitorizados nos tempos 0, 1, 3 e 7 dias de incubação, com recurso a métodos de cultivo, PCR quantitativo (qPCR) e análises da comunidade bacteriana com base Resumo xii na sequência nucleotídica de amplicões do gene para o rRNA 16S. Na comunidade bacteriana do material fecal predominavam membros dos filos Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria e Verrucomicrobia. Esta comunidade sofreu aumento na abundância relativa de Proteobacteria, quando os FMA foram incubados na presença de oxigénio. A presença de doses sub-inibitórias de antibióticos não esteve associada a variações relevantes na composição da comunidade microbiana. Os ARGs das ARB inoculadas persistiram durante o período de 7 dias em todos os ensaios e, ao fim de 30 dias, podiam ainda ser quantificados, tanto em condições de aerobiose como de anaerobiose. A adição de doses sub-inibitórias de antibióticos não se correlacionou com variações significativas na persistência das ARB ou ARGs testados, quando comparados os respetivos controlos em antibióticos. Este estudo sugeriu que ARB que vivem em águas residuais podem persistir pelo menos por uma semana na presença de microbiota fecal complexa e, mesmo quando essas ARB estão abaixo do limite de detecção cultivável, os seus ARGs eram quantificáveis por qPCR. Esses resultados apoiam a hipótese de que, se as bactérias das águas residuais, por acaso, atingirem o intestino humano, poderá haver uma colonização bem-sucedida, um tema que merece mais investigação. No geral, a investigação realizada nesta tese sugere que as águas residuais tratadas usadas para irrigação podem conter bactérias com relevância clínica que, por essa via, podem estabelecer associação estável com culturas edíveis, como endófitos. Se, como consequência desse fato, essas bactérias atingirem o intestino humano, há indícios de que terão capacidade para ali persistir. Embora os presentes estudos evidenciem a complexidade desta questão, a tese apresentada sustenta que as águas residuais, as variedades agrícolas edíveis e os humanos podem estar interligados na cadeia de transmissão de ARB e ARGs. Assim, esta tese abre também caminhos para novas investigações neste domínio.
- Post-alcoholic fermentation micro-ecology of wines : the role of phenolic composition and the effects on qualityPublication . Collombel, Ingrid Pascale; Hogg, Timothy Alun; Campos, Francisco Manuel Morais Sarmento deThe research presented in this thesis explores the interactions between certain phenolic compounds that are naturally present in wines and the microorganisms that are generally present in this medium. The interactions studied include the effects on microbial growth and metabolism, the intra-specific diversity of Oenococcus oeni and the evolution of volatile and non-volatile compounds during malolactic fermentations (MLF) and subsequent storage. The ability of several strains of lactic acid bacteria (LAB) to release hydroxycinnamic acids (HCA) from their tartrate derivative forms ((hydroxy)cinnamoyl-tartaric acids) was also studied. Metabarcoding analysis of 16 different wines analyzed at the post-malolactic stage was performed using sequence data from 16S (for bacteria) and ITS2 (for fungi) amplicons. Similar patterns were observed in all wines at this level of discrimination, with Saccharomyces cerevisiae yeasts and bacteria from the genera Acetobacter, Gluconobacter and Swaminathania being the most abundant taxa. Concerning the profiles of phenolics and volatiles, red and white wines were grouped separately, and French and Spanish wines tended to cluster together. The effects of kaempferol, trans-caffeic and trans-caftaric acids (added at 10 mg/L) on the microbial growth and metabolism were explored in non-inoculated and inoculated wine (O. oeni) and wine mixed with MRS (de Man, Rogosa & Sharpe). The strongest impact on microbial growth, malolactic and general metabolic activity in LAB, was noted for kaempferol, with trans-caftaric acid showing the weakest. The effects of each phenolic compound varied according to the medium used, the type of MLF (inoculated or not) and the O. oeni strain inoculated (OenosTM or CH35TM). Using concentrations normally encountered in wines as a reference, flavan-3-ols ((+)-catechin and (-)-epicatechin), flavonols (kaempferol and quercetin), HCA (trans-p-coumaric and trans-ferulic acids) and trans-resveratrol were studied in experiments with non-inoculated wines and wines inoculated with OenosTM. Depending on its concentration, (+)-catechin positively impacted the yeast population, activated or delayed malic acid degradation or inhibited the growth of bacteria. All phenolics tested, at all concentrations tested, delayed citrate consumption in inoculated samples. The effect of flavonols and trans-resveratrol on the O. oeni diversity was dependent on the strains under study. An increase in trans-p-coumaric and trans-ferulic acid levels appeared to induce the release of trans-caffeic acid from one of its precursors, possibly via an increase in cinnamoyl esterase activity of some strains. Flavan-3-ols and flavonols inhibited the growth of these bacteria during storage. The phenolics tested affected specific enzymatic systems responsible for the production and degradation of important metabolites involved in the organoleptic quality of the wines. Cinnamoyl esterase (CE) activity of wine microbes can be relevant as it confers the capacity to modulate the phenolic acid composition of a wine by liberating these from otherwise seemingly biologically unavailable, tartrate derivatives. Five commercial strains of O. oeni were studied in this respect, three exhibiting CE activity (OenosTM, CiNeTM and CH35TM) and two not (CH16TM and CH11TM). CE activity was detected in cell-free extracts of the three CE positive (CE+) strains and one of the CE negative (CE-) strains. From comparative genome analysis, no gene exclusive to the 3 CE+ was detected and the inference that membrane transport differences might be behind differences in CE activity was also not conclusively supported. This hypothesis needs to be further explored as does the possibility of the involvement of wine molecules and of more than one enzyme in the CE activity.
- Survival, metabolism and production of volatile phenols by Dekkera bruxellensis in monovarietal winesPublication . Lima, Adriana Nunes de; Couto, José António Gomes; Campos, Francisco Manuel Morais Sarmento deThe specific defect caused by the production of volatile phenolic compounds in wines is a major economic concern among wine producers at a global scale. Vinylphenols and, specially, ethylphenols may accumulate in wines imparting undesirable odours and flavours, which may strongly affect the wine quality. The main organisms responsible for the production of these compounds are the yeasts Brettanomyces/Dekkera. Several studies have been carried out on this subject over the last 20 years, but scientific work concerning the relationship between the grape varieties and the production of volatile phenols is extremely scarce. Thus, the overall aim of this work was to characterise the survival and metabolic behaviour of Dekkera bruxellensis in monovarietal wines and to evaluate whether certain grape varieties pose a higher risk to develop volatile phenols. The work started by searching for contaminated wines and by isolating strains of Brettanomyces/Dekkera using selective and differential culture media. The percentage of contaminated wines was 37% and all strains isolated were identified as Dekkera bruxellensis. The results support the view that, among the Brettanomyces/Dekkera yeasts, D. bruxellensis is the main species responsible for the production of volatile phenols in wines. Phenotypic variation was found among the strains studied regarding the tolerance to ethanol. The most tolerant strains were able to grow at 14% v/v ethanol and the wine isolates were, in general, more tolerant than the reference strain D. bruxellensis PYCC 4801. Strains, from the most tolerant group, were selected to perform survival and metabolic studies in real wine conditions. Prior to the metabolic studies, a chemical characterisation of monovarietal red wines from eight selected grape varieties (Cabernet Sauvignon, Syrah, Aragonez, Castelão, Touriga Franca, Touriga Nacional, Trincadeira and Vinhão) was performed, focusing on the volatile phenols and on the respective precursor compounds, both on the free and bond forms. It was found that the precursors exist mostly as esters of tartaric acid (caftaric, coutaric and fertaric acids). The predominant free hydroxycinnamic acid was p-coumaric acid, the highest concentrations being found in Syrah and Touriga Franca and the lowest in Touriga Nacional and Trincadeira. Touriga Nacional exhibited the highest difference between bound and free forms. Twenty two % of the wines analysed presented levels of volatile phenols above the perception threshold, the highest vi values being found in Vinhão and Trincadeira. The results show relevant differences among grape varieties but the availability of precursors on the free form may not be the only factor explaining the potential of wines to develop volatile phenols. The survival of D. bruxellensis in monovarietal wines (Touriga Nacional, Cabernet Sauvignon and Syrah) and the metabolism of hydroxycinnamic acids were evaluated. After the inoculation, yeast culturable populations were reduced to undetectable numbers in all wines, but viability measurement by flow cytometry showed that a significant part of the populations were in a viable-but-not-culturable state (VBNC). VBNC cells were metabolically active, causing the spoilage of the wine, and this physiological state favoured the accumulation of vinylphenols rather than ethylphenols independently of the grape variety. The survival capacity of D. bruxellensis was higher on Touriga Nacional wines than in Cabernet Sauvignon and Syrah. Wine susceptibility to Dekkera may be correlated with the phenolic composition, specifically the bound/free molar ratios of hydroxycinnamic acids. As stated above, Touriga Nacional exhibited the highest difference between bound and free forms and the level of free hydroxycinnamic acids is relatively low in comparison with other grape varieties. Therefore, the documented antimicrobial activity of free hydroxycinnamic acids may be expected to be lower in Touriga Nacional wines. Besides the production of volatile phenols, D. bruxellensis showed esterase activity leading to the increase on the amount of ethyl esters, including ethyl acetate. The fatty acids isovaleric acid and caprylic acid also increased in the inoculated wines. The concentration of monoterpenes analysed increased in the Cabernet Sauvignon wines but not in Touriga Nacional wines. The grape variety effect observed can be related with different compositions of glycosidically bound terpenes subjected to the ß-glycosidase activity of D. bruxellensis.
- Utilization of omega-3 and conjugated fatty acids to develop new antiobesity strategiesPublication . Salsinha, Ana Sofia Nobre; Pintado, Maria Manuela Estevez; Relvas, João Bettencourt; Alcalá, Luis Miguel RodriguesAccording to the World Health Organization's latest data, overweight and obesity prevalence is increasing mostly in urban settings. Diet, particularly the rise of the Western diet, characterized by high-sugar and high-saturated fat consumption, has been pointed out as one important contributor to this trend. Western diet has been shown to detrimentally affect brain function by inducing chronic low-grade inflammation. This neuroinflammation is in part mediated by microglia, so the first part of this study intended to determine how different bioactive fatty acids, namely omega-3 and conjugated fatty acids isomers (conjugated linoleic (CLA) and linolenic acid (CLNA) isomers) modulate microglia activity and if they can suppress the negative effect of obesogenic nutrients (palmitic acid and fructose), intended to mimic in this study the Western diet main ingredients. Importantly, short-time exposure to omega-3, CLA, and CLNA was demonstrated, for the first time, to be sufficient to abolish NF-κB pathway activation, reactive oxygen species production, and the activation of LynSrc in a human microglia cell line, suggesting a potential for neuroprotection. Interestingly, the NF-κB pathway activation was demonstrated for the first time for CLA and CLNA, to be mediated by the GPR120 receptor. Nevertheless, despite this promising potential one of the most straightforward routes of administration is through oral supplementation and the use of enriched oils has been used as a strategy to achieve therapeutical doses of the mentioned bioactive fatty acids. So, to explore the antiobesity potential of omega-3 and conjugated fatty acids, through oral supplementation, bioaccessibility and bioavailability are important parameters to consider. So, in the second stage of this work, the bioaccessibility of these fatty acids in different matrixes was determined using the INFOGEST static in vitro protocol of gastrointestinal tract simulation. After digestion the recovery index for most of the major bioactive fatty acids – punicic acid, the omega-3 EPA, DPA, and DHA fatty acids, and the CLA isomers, rumenic acid, and C18:2 t10c12 - was very low between 1.90-17.03%, demonstrating the negative effect of gastrointestinal digestion upon these fatty acids in this type of matrix. Besides, using a Caco-2/HT29-MTX co-culture it was demonstrated that a significative percentage of these fatty acids is incorporated in the intestinal cells (8.44-26.71%), which may affect their permeability performance and explain the null apparent permeability values obtained. Moreover, due to this observation, it was demonstrated that in fact, most of them remain in the non-bioaccessible/ colon-available fraction. Despite the drawbacks of this observation in terms of brain bioavailability, the potential of gut microbiota modulation was considered. Western diet has been considered one important player in the gut microbiota alterations in industrialized societies and a causal role between gut microbiota changes and obesity has been demonstrated. So, the third stage of this work intended to assess the effects of omega-3, CLA, and punicic acid on human gut microbiota modulation using in vitro fecal fermentations. Indeed, all the samples demonstrated a positive impact, demonstrated by positive relative difference indexes concerning the negative control (RD>0), in the growth of key bacteria that have been associated with a positive effect on obesity treatment namely Akkermansia spp., Bifidobacterium spp., and Roseburia spp. In addition, most samples (Fish oil, Omega-3, CLA, and CLNA capsules content) were able to increase butyrate concentration, a known anti-inflammatory short-chain fatty acid. Moreover, demonstrating the potential of gut-brain axis modulation and its importance in brain function restoration, the sources of omega-3 (Fish oil and Omega-3 capsules content) were able to increase the concentration of GABA and several amino acids that are known precursors of neurotransmitters. Importantly, this first gut microbiota study demonstrated the potential role of these fatty acids in gut microbiota modulation and a possible prediction of their preventive and therapeutical role in obesity. So, a second study intended to assess if the selected oils enriched in omega-3 (Fish oil) and punicic acid (Pomegranate oil) could restore the gut microbiota changes associated with the Western diet that are frequently linked to conditions like obesity and other metabolic diseases, such as type 2 diabetes mellitus. So, Fish oil (as the selected source of omega-3), Pomegranate oil (as a source of punicic acid), and a mixture of both oils (1:1 w/w) were subjected to in vitro fermentations using cecal samples from rats subjected either to a control standard chow diet or to a western diet (high-fat and high-sugar diet). Fish oil+Pomegranate oil was able to increase α-diversity, the relative abundance of the Firmicutes and Bacteroidetes phylum as well as Akkermansia and Blautia, which were affected by the western diet consumption. All samples were able to increase butyrate and acetate concentration in the western diet group. Once again, demonstrating the great potential of these samples to modulate the gut-brain axis, especially in a metabolic syndrome context, tyrosine, a precursor for dopamine and norepinephrine, and GABA concentrations increase in the Fish oil+Pomegranate oil sample from the western diet group. Finally, to tentatively uncover some of the molecular mechanisms behind these bioactive fatty acids' effects on gut permeability and adipogenesis, the role of CB1 in both these processes and GPR120 in adipogenesis was studied. Interestingly, it was demonstrated that CB1 may have a role in intestinal permeability and different bioactive polyunsaturated fatty acids may respond differently to this receptor. Moreover, there seems to be an important role of both GPR120 and CB1 (studied separately) in Fish and Pomegranate oil inhibitory adipogenesis effects in the studied cell model (3T3-L1 adipocytes). In this thesis, it was demonstrated, for the first time, the great potential of using bioactive fatty acids, namely omega-3 and punicic acid to promote a systemic effect in obesity prevention and therapy. Moreover, it was demonstrated a synergistic effect of these bioactive fatty acids, by using a mixture of Fish and Pomegranate oil, to restore the gut microbiota changes associated with western diet consumption. Despite these promising results, further studies using as a first approach animal models (such as rodent models) and afterward a clinical trial using human patients, are required to fully elucidate the bioavailability of such bioactive fatty acids in a dietary context and consequently, their possible beneficial role in brain inflammatory processes either directly or via gut-brain axis modulation.