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Authors
Abstract(s)
The specific defect caused by the production of volatile phenolic compounds in wines is a major
economic concern among wine producers at a global scale. Vinylphenols and, specially,
ethylphenols may accumulate in wines imparting undesirable odours and flavours, which may
strongly affect the wine quality. The main organisms responsible for the production of these
compounds are the yeasts Brettanomyces/Dekkera. Several studies have been carried out on this
subject over the last 20 years, but scientific work concerning the relationship between the grape
varieties and the production of volatile phenols is extremely scarce. Thus, the overall aim of this
work was to characterise the survival and metabolic behaviour of Dekkera bruxellensis in
monovarietal wines and to evaluate whether certain grape varieties pose a higher risk to develop
volatile phenols.
The work started by searching for contaminated wines and by isolating strains of
Brettanomyces/Dekkera using selective and differential culture media. The percentage of
contaminated wines was 37% and all strains isolated were identified as Dekkera bruxellensis.
The results support the view that, among the Brettanomyces/Dekkera yeasts, D. bruxellensis is
the main species responsible for the production of volatile phenols in wines. Phenotypic
variation was found among the strains studied regarding the tolerance to ethanol. The most
tolerant strains were able to grow at 14% v/v ethanol and the wine isolates were, in general,
more tolerant than the reference strain D. bruxellensis PYCC 4801. Strains, from the most
tolerant group, were selected to perform survival and metabolic studies in real wine conditions.
Prior to the metabolic studies, a chemical characterisation of monovarietal red wines from eight
selected grape varieties (Cabernet Sauvignon, Syrah, Aragonez, Castelão, Touriga Franca,
Touriga Nacional, Trincadeira and Vinhão) was performed, focusing on the volatile phenols and
on the respective precursor compounds, both on the free and bond forms. It was found that the
precursors exist mostly as esters of tartaric acid (caftaric, coutaric and fertaric acids). The
predominant free hydroxycinnamic acid was p-coumaric acid, the highest concentrations being
found in Syrah and Touriga Franca and the lowest in Touriga Nacional and Trincadeira. Touriga
Nacional exhibited the highest difference between bound and free forms. Twenty two % of the
wines analysed presented levels of volatile phenols above the perception threshold, the highest
vi
values being found in Vinhão and Trincadeira. The results show relevant differences among
grape varieties but the availability of precursors on the free form may not be the only factor
explaining the potential of wines to develop volatile phenols.
The survival of D. bruxellensis in monovarietal wines (Touriga Nacional, Cabernet Sauvignon
and Syrah) and the metabolism of hydroxycinnamic acids were evaluated. After the inoculation,
yeast culturable populations were reduced to undetectable numbers in all wines, but viability
measurement by flow cytometry showed that a significant part of the populations were in a
viable-but-not-culturable state (VBNC). VBNC cells were metabolically active, causing the
spoilage of the wine, and this physiological state favoured the accumulation of vinylphenols
rather than ethylphenols independently of the grape variety. The survival capacity of D.
bruxellensis was higher on Touriga Nacional wines than in Cabernet Sauvignon and Syrah.
Wine susceptibility to Dekkera may be correlated with the phenolic composition, specifically
the bound/free molar ratios of hydroxycinnamic acids. As stated above, Touriga Nacional
exhibited the highest difference between bound and free forms and the level of free
hydroxycinnamic acids is relatively low in comparison with other grape varieties. Therefore,
the documented antimicrobial activity of free hydroxycinnamic acids may be expected to be
lower in Touriga Nacional wines.
Besides the production of volatile phenols, D. bruxellensis showed esterase activity leading to
the increase on the amount of ethyl esters, including ethyl acetate. The fatty acids isovaleric acid
and caprylic acid also increased in the inoculated wines. The concentration of monoterpenes
analysed increased in the Cabernet Sauvignon wines but not in Touriga Nacional wines. The
grape variety effect observed can be related with different compositions of glycosidically bound
terpenes subjected to the ß-glycosidase activity of D. bruxellensis.
A produção de fenóis voláteis em vinhos tem sérias repercussões económicas nas empresas, pelo que continua a ser fonte de grande preocupação na indústria vínica a nível mundial. A presença de vinilfenóis e, em especial, os etilfenóis acima de determinados valores confere odores e sabores indesejáveis que podem afectar, drasticamente, a qualidade do vinho. Os principais organismos responsáveis pela produção desses compostos são as leveduras Brettanomyces/Dekkera. Diversos estudos foram realizados sobre este assunto nos últimos 20 anos, focando principalmente na origem/fontes de Brettanomyces/Dekkera, nas condições necessárias para o seu desenvolvimento no vinho, nos requisitos nutricionais, em métodos de detecção e identificação e em estratégias para controlar o problema. Mas, trabalho científico sobre a relação entre as castas de uvas e a produção de fenóis voláteis é escasso. Assim, o objetivo geral desta tese foi caracterizar a sobrevivência e o comportamento metabólico de Dekkera bruxellensis em vinhos monovarietais e avaliar se determinadas castas apresentam maior risco de desenvolvimento de fenóis voláteis. O trabalho começou pela pesquisa de vinhos contaminados e pelo isolamento de estirpes de Brettanomyces/Dekkera usando meios de cultura seletivos e diferenciais. A percentagem de vinhos contaminados foi de 37% e todas as estirpes isoladas foram identificadas como Dekkera bruxellensis. Os resultados confirmam que, entre as leveduras Brettanomyces/Dekkera, D. bruxellensis é a principal espécie responsável pela produção de fenóis voláteis nos vinhos. Foi observada variação fenotípica entre as estirpes estudadas quanto à tolerância ao etanol. As mais tolerantes foram capazes de crescer na presença de 14% v/v etanol e, de uma forma geral, os isolados vínicos foram mais tolerantes do que a estirpe de referência D. bruxellensis PYCC 4801. Estirpes do grupo mais tolerante foram selecionadas para realizar estudos metabólicos e de sobrevivência em condições reais de vinho. Antes dos estudos de metabolismo, foi feita a caracterização química de vinhos tintos monovarietais de oito castas selecionadas (Cabernet Sauvignon, Syrah, Aragonez, Castelão, Touriga Franca, Touriga Nacional, Trincadeira e Vinhão), focando nos fenóis voláteis e respectivos compostos precursores, tanto na forma livre como na forma ligada. Verificou-se que viii os precursores existem principalmente como ésteres de ácido tartárico (ácido caftárico, coutárico e fertárico). O ácido hidroxicinâmico predominante foi o ácido p-cumárico, sendo as maiores concentrações encontradas em Syrah e Touriga Franca e as mais baixas em Touriga Nacional e Trincadeira. A casta Touriga Nacional exibiu a maior diferença entre formas livres e ligadas. Vinte e dois % dos vinhos analisados apresentaram níveis de fenóis voláteis acima do limiar de percepção, sendo os valores mais elevados encontrados em Vinhão e Trincadeira. Os resultados mostram diferenças relevantes entre as castas, mas a disponibilidade de precursores na forma livre não é o único fator que explica o potencial dos vinhos para desenvolver fenóis voláteis. A sobrevivência de D. bruxellensis em vinhos monovarietais (Touriga Nacional, Cabernet Sauvignon e Syrah) e o metabolismo dos ácidos hidroxicinâmicos foram avaliados. Após a inoculação, as populações de leveduras cultiváveis foram reduzidas para números indetectáveis em todos os vinhos, mas a determinação da viabilidade por citometria de fluxo mostrou que uma parte significativa das populações estava em no estado viável mas não cultivável (VNC). Células VNC mostraram ser metabolicamente ativas causando a deterioração do vinho, e este estado fisiológico favoreceu a acumulação de vinilfenóis, independentemente da casta. A capacidade de sobrevivência de D. bruxellensis foi maior nos vinhos Touriga Nacional do que em Cabernet Sauvignon e Syrah. A susceptibilidade do vinho a Dekkera pode estar correlacionada com a composição fenólica dos vinhos, especificamente a proporção de ácidos hidroxicinâmicos livres/ligados. Tal como acima referido, a casta Touriga Nacional exibiu a maior diferença entre as formas livres e ligadas e concentração de ácidos hidroxicinâmicos livres é relativamente baixo em comparação com as outras castas. Assim, podemos esperar que a reconhecida atividade antimicrobiana dos ácidos hidroxicinâmicos livres seja menor nos vinhos Touriga Nacional. Além da produção de fenóis voláteis, D. bruxellensis mostrou atividade esterásica levando ao aumento da quantidade de ésteres etílicos, incluindo o acetato de etilo. Os ácidos gordos isovalérico e caprílico também aumentaram nos vinhos inoculados. A concentração de monoterpenos analisados aumentou nos vinhos Cabernet Sauvignon mas não nos vinhos Touriga Nacional. A influência da casta pode estar relacionada com a composição de terpenos ligados a açúcares, sujeitos à atividade ß-glicosidásica de D. bruxellensis.
A produção de fenóis voláteis em vinhos tem sérias repercussões económicas nas empresas, pelo que continua a ser fonte de grande preocupação na indústria vínica a nível mundial. A presença de vinilfenóis e, em especial, os etilfenóis acima de determinados valores confere odores e sabores indesejáveis que podem afectar, drasticamente, a qualidade do vinho. Os principais organismos responsáveis pela produção desses compostos são as leveduras Brettanomyces/Dekkera. Diversos estudos foram realizados sobre este assunto nos últimos 20 anos, focando principalmente na origem/fontes de Brettanomyces/Dekkera, nas condições necessárias para o seu desenvolvimento no vinho, nos requisitos nutricionais, em métodos de detecção e identificação e em estratégias para controlar o problema. Mas, trabalho científico sobre a relação entre as castas de uvas e a produção de fenóis voláteis é escasso. Assim, o objetivo geral desta tese foi caracterizar a sobrevivência e o comportamento metabólico de Dekkera bruxellensis em vinhos monovarietais e avaliar se determinadas castas apresentam maior risco de desenvolvimento de fenóis voláteis. O trabalho começou pela pesquisa de vinhos contaminados e pelo isolamento de estirpes de Brettanomyces/Dekkera usando meios de cultura seletivos e diferenciais. A percentagem de vinhos contaminados foi de 37% e todas as estirpes isoladas foram identificadas como Dekkera bruxellensis. Os resultados confirmam que, entre as leveduras Brettanomyces/Dekkera, D. bruxellensis é a principal espécie responsável pela produção de fenóis voláteis nos vinhos. Foi observada variação fenotípica entre as estirpes estudadas quanto à tolerância ao etanol. As mais tolerantes foram capazes de crescer na presença de 14% v/v etanol e, de uma forma geral, os isolados vínicos foram mais tolerantes do que a estirpe de referência D. bruxellensis PYCC 4801. Estirpes do grupo mais tolerante foram selecionadas para realizar estudos metabólicos e de sobrevivência em condições reais de vinho. Antes dos estudos de metabolismo, foi feita a caracterização química de vinhos tintos monovarietais de oito castas selecionadas (Cabernet Sauvignon, Syrah, Aragonez, Castelão, Touriga Franca, Touriga Nacional, Trincadeira e Vinhão), focando nos fenóis voláteis e respectivos compostos precursores, tanto na forma livre como na forma ligada. Verificou-se que viii os precursores existem principalmente como ésteres de ácido tartárico (ácido caftárico, coutárico e fertárico). O ácido hidroxicinâmico predominante foi o ácido p-cumárico, sendo as maiores concentrações encontradas em Syrah e Touriga Franca e as mais baixas em Touriga Nacional e Trincadeira. A casta Touriga Nacional exibiu a maior diferença entre formas livres e ligadas. Vinte e dois % dos vinhos analisados apresentaram níveis de fenóis voláteis acima do limiar de percepção, sendo os valores mais elevados encontrados em Vinhão e Trincadeira. Os resultados mostram diferenças relevantes entre as castas, mas a disponibilidade de precursores na forma livre não é o único fator que explica o potencial dos vinhos para desenvolver fenóis voláteis. A sobrevivência de D. bruxellensis em vinhos monovarietais (Touriga Nacional, Cabernet Sauvignon e Syrah) e o metabolismo dos ácidos hidroxicinâmicos foram avaliados. Após a inoculação, as populações de leveduras cultiváveis foram reduzidas para números indetectáveis em todos os vinhos, mas a determinação da viabilidade por citometria de fluxo mostrou que uma parte significativa das populações estava em no estado viável mas não cultivável (VNC). Células VNC mostraram ser metabolicamente ativas causando a deterioração do vinho, e este estado fisiológico favoreceu a acumulação de vinilfenóis, independentemente da casta. A capacidade de sobrevivência de D. bruxellensis foi maior nos vinhos Touriga Nacional do que em Cabernet Sauvignon e Syrah. A susceptibilidade do vinho a Dekkera pode estar correlacionada com a composição fenólica dos vinhos, especificamente a proporção de ácidos hidroxicinâmicos livres/ligados. Tal como acima referido, a casta Touriga Nacional exibiu a maior diferença entre as formas livres e ligadas e concentração de ácidos hidroxicinâmicos livres é relativamente baixo em comparação com as outras castas. Assim, podemos esperar que a reconhecida atividade antimicrobiana dos ácidos hidroxicinâmicos livres seja menor nos vinhos Touriga Nacional. Além da produção de fenóis voláteis, D. bruxellensis mostrou atividade esterásica levando ao aumento da quantidade de ésteres etílicos, incluindo o acetato de etilo. Os ácidos gordos isovalérico e caprílico também aumentaram nos vinhos inoculados. A concentração de monoterpenos analisados aumentou nos vinhos Cabernet Sauvignon mas não nos vinhos Touriga Nacional. A influência da casta pode estar relacionada com a composição de terpenos ligados a açúcares, sujeitos à atividade ß-glicosidásica de D. bruxellensis.