R - Teses de Doutoramento / Doctoral Theses
Permanent URI for this collection
Browse
Browsing R - Teses de Doutoramento / Doctoral Theses by Field of Science and Technology (FOS) "Ciências Médicas::Biotecnologia Médica"
Now showing 1 - 9 of 9
Results Per Page
Sort Options
- Acinetobacter and public health : risks posed by strains isolated from foodsPublication . Carvalheira, Ana Isabel Teixeira; Teixeira, Paula Cristina Maia; Silva, Joana Gabriela Laranjeira daAcinetobacter spp. has emerged as a pathogen of a major public health concern due to their increased resistance to antibiotics and their association with a wide range of nosocomial infections. The aim of this work was to gain insight into the food-related ecology and epidemiology of Acinetobacter spp. and to compare food and clinical strains regarding biofilm production, resistance to desiccation and disinfectant susceptibility. As there is no standard procedure to recover Acinetobacter spp. from food, two selective enrichment media were evaluated for the recovery of low levels of these organisms. Enrichment in Dijkshoorn enrichment medium followed by plating on CHROMagarTM Acinetobacter medium was shown to be a reliable method. Using this procedure, Acinetobacter spp. were isolated from 77.9% of fruit (35/50) and vegetables (39/45) samples and from all the meat analysed (50). A high genetic diversity established by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was observed among the isolates and based on the analysis of the partial sequence of rpoB,181 strains ecovered from fruits and vegetables and 156 strains recovered from meat samples were identified as members of eighteen and thirteen distinct species, respectively. Acinetobacter calcoaceticus and Acinetobacter johnsonii were the most common species (both with the frequency of 26.5%) recovered from fruit and vegetables, while Acinetobacter guillouiae (34.9%), A. johnsonii (15%) and A. bereziniae (12%) were the most common species recovered from meats. Acinetobacter spp. belonging to the A. baumannii group (11.0% from fuit and vegetables, 18.7% from meats), which is most frequently associated with nosocomial infections worldwide, were also recovered. Most of these strains were resistant to some of the antimicrobials recommended to treat Acinetobacter infections such as piperacillin¬tazobactam, ceftadidime, ciprofloxacin, as well as to colistin and polymyxin B, the last-resort drugs to treat infections caused by multidrug-resistant Acinetobacter. Overall, 29.8% of the isolates from fruit and lettuces, and 51.2% of the isolates from meats were classified as multidrug¬resistant (MDR), and 4.4% and 9.6% as extensively drug-resistant (XDR), respectively. The taxonomic status of six strains of Acinetobacter obtained from meats, was investigated, using a polyphasic analysis, since their partial rpoB sequence similarities to other Acinetobacter species with validly published names were lower than 95%. The species status of two groups was confirmed by comparative multilocus sequence analysis, including also the gyrB, recA and 16S rRNA genes, low (below 95%) whole-genome sequence (WGS) average nucleotide identity (ANI) values and low (below 70%) digital DNA¬DNA hybridization (dDDH) similarities between the WGS of the proposed type strains of each novel species and the representatives of the known Acinetobacter species. Phylogenomic treeing from core genome analysis supported these results as well as, the coherence of each new species¬lineage was supported by matrix-assisted laser desorption/ionization time¬of-flight mass spectrometry, differentiation of the species at the protein level by cellular fatty acids profiles and by unique and differential combinations of metabolic and physiological properties shared by each novel species. These strains represented two coherent lineages that were distinct from each other and from all known species, and the names Acinetobacter portensis sp. nov. (four strains: AC 877T = CCUG 68672T = CCM 8789T as type strain), and Acinetobacter guerrae sp. nov. (two strains: AC 1271T = CCUG 68674T = CCM 8791T as type strain) were proposed for these novel species. Control the dissemination of A. baumannii is challenging mainly due to its high adaptability to adverse environmental conditions. The biofilm formation ability in silicon and stainless steel, the resistance to desiccation on a stainless steel surface and the susceptibility to eleven commercial antimicrobial products was compared between food (10) and clinical strains (10). The clinical strains were selected based on their presumptive persistent and non-persistent status among 104 isolates recovered from patients in Hospital de São Marcos, Braga. Predominant clones of MDR A. baumannii repeatedly isolated in different years (2004 to 2007) or in different months (isolates recovered in 2014) were defined as persistent and strains recovered sporadically (with a PFGE pattern observed only once among all isolates) were defined as non-persistent. There were no significant differences between clinical and food strains since all the strains were able to form biofilm on silicon and stainless steel surfaces, exhibited desiccation resistance capacity ranging from 14 to 77 days and were susceptible to disinfectants at the recommended use concentrations. However, the biofiom-forming capacity of persistent strains was significantly higher than the non-persistant strains on both surfaces. The resistance to desiccation of persistent strains (mean survival time: 65.8 days) was also significantly longer than that of the non-persistent strains (mean survival time: 35.8 days). Therefore, these factors may contribute to their maintenance in the hospital setting. A high intra¬species variability in susceptibility to disinfectants was observed for A. baumannii and there was no correlation between the efficiency of disinfectants and the origin of the isolates. Moreover, no correlation between antibiotic resistance and biofilm production, resistance to desiccation and disinfectant susceptibility was found. Therefore, food products may be a potential vehicle of spread in the community and clinical environments of Acinetobacter strains resistant to several antibiotics, able to produce biofilm and to survive to desiccation, which may led to nosocomial and community¬acquired infections in susceptible individuals.
- Chitosan in textiles : towards a greener and functional solutionPublication . Costa, Eduardo Manuel Aguiar da; Pintado, Maria Manuela Estevez; Tavaria, Freni Kekhasharú; Faria, JorgeO nível de exigência sobre a produção de produtos manufaturados tem aumentado nos últimos anos, com especial atenção a ser dada à pegada ambiental do setor industrial. O setor têxtil é uma indústria com um consumo elevado de recursos (água, energia, etc.), utiliza químicos perigosos e tóxicos e produz águas residuais extremamente poluídas. Numa tentativa de produzir soluções mais amigas do ambiente, a indústria têxtil substituiu o tradicional conceito “tratamento da poluição” pelo conceito de “prevenção da poluição”. Assim sendo tecnologias e conceitos que favoreçam este conceito são vantajosas e de grande interesse de um ponto de vista industrial e económico. O primeiro passo deste trabalho teve por objetivo caracterizar e otimizar a produção de nanopartículas de quitosana capazes de incorporar corantes têxteis para serem utilizadas nas restantes fases deste trabalho. A otimização da produção de nanopartículas foi realizada através de gelificação iónica com 3 fatores físicos (tempo de adição de tripolifosfato, tempo de reação e velocidade de rotação) a serem avaliados. Os resultados obtidos mostraram que foi possível definir parâmetros físicos ótimos de produção das nanopartículas e que estas foram homogeneamente produzidas a pH 5. Adicionalmente, a caracterização das nanopartículas mostrou que estas eram biocompatíveis com células HaCat e estáveis à liofilização e armazenamento na presença de 10% (m/v) de manitol. A segunda fase desta tese focou-se na produção de corantes têxteis nanoencapsulados e no estudo da ligação destes a têxteis. Corantes têxteis reativos e dispersos foram nanoencapsulados com sucesso com a obtenção de percentagens de encapsulação médias superiores a 90% e as nanopartículas produzidas a possuírem um potencial zeta positivo e tamanho entre 190 e 800 nm. Adicionalmente, os corantes nanoencapsulados não apresentaram qualquer citotoxicidade relativamente a células HaCat e, acima de tudo, para as nanopartículas produzidas não foi observada a tradicional especificidade corante-tecido dado que estas foram capazes de corar todos os tecidos naturais e sintéticos testados. Após os corantes terem sido nanoencapsulados com sucesso, o foco seguinte do trabalho foi a validação das propriedades biológicas das nanopartículas e dos seus constituintes. Para alcançar esse objetivo foi elaborada uma abordagem multi-etapas, com a fase inicial a consistir na validação da atividade biológica, em ambiente planctónico e séssil, da quitosana e depois de nanopartículas vazias a ser validada relativamente a vários microrganismos patogénicos da pele resistentes a antibióticos (e.g. MRSA, MRSE e VRSA). Os resultados obtidos mostraram que tanto a quitosana como as suas nanopartículas vazias apresentaram concentrações mínimas inibitórias e bactericidas (CMI e CMB) baixas, reduziram rapidamente o número de contagens bacterianas viáveis, inibiram a adesão bacteriana e formação de biofilme e, as nanopartículas vazias, foram capazes de reduzir as contagens viáveis in vivo num modelo de infeção de células HaCat. No seguimento destes resultados a atividade biológica das nanopartículas de corante foi avaliada contra os mesmos microrganismos da pele resistentes a antibióticos, com os resultados obtidos a mostrarem que os corantes têxteis nanoencapsulados inibiram o crescimento de todos os microrganismos testados em ambientes planctónico e séssil. Em crescimento planctónico as nanopartículas registaram valores de CMI entre 0.5 e 2 mg/mL e de CMB entre 1 a 3 mg/mL. Relativamente à atividade sobre a biofilmes bacterianos as nanopartículas foram eficazes na inibição da formação de biofilme e do mecanismo de quorum sensing, com percentagens de inibição entre 30 e 87% a serem registradas para o primeiro e atingirem ca. 100% para o segundo. Adicionalmente, as nanopartículas de corante têxtil não tiveram qualquer efeito adverso no metabolismo e integridade da membrana da linhagem celular HaCat e foram capazes de reduzir significativamente as contagens viáveis intracelulares e extracelulares de MRSA num modelo de infeção de células HaCat. Como as nanopartículas de corantes mostraram ser capazes de corar têxteis e possuem uma atividade biológica assinalável, a última fase desta tese teve por objetivo encontrar resposta à pergunta – serão os têxteis corados com esta metodologia biologicamente ativos? Os resultados obtidos mostraram que os têxteis corados não possuíam qualquer efeito citotóxico sobre a linhagem celular HaCat e que o processo de tingimento também funcionaliza os têxteis, pois o algodão corado com nanopartículas foi capaz de reduzir efetivamente as contagens viáveis de MSSA, MRSA e Acinetobacer baumannii. Adicionalmente, a análise da interação das nanopartículas com o algodão mostrou que esta ocorre através de interação iónica e de pontes de hidrogénio e que as nanopartículas cobrem cada fibra individual ficando achatadas na superfície das mesmas. Em resumo, a metodologia de tingimento têxtil proposta demonstra ser um processo fácil e que possibilita em um só passo tingir e funcionalizar têxteis. Considerando que este processo não requer adição de sais ou adjuvantes químicos e que não existe qualquer especificidade corante-tecido, a aplicação desta metodologia na indústria têxtil poderá alterar o modo como a mesma ópera e diminuir a sua pegada ambiental.
- Criopreservação embrionária e neuro desenvolvimento infantilPublication . Neves, Célia Francisca Iglésias Batista; Osswald, Walter Friedrich Alfred; Serrão, Daniel; Jacomo, AntónioINTRODUÇÃO - O extraordinário avanço da procriação medicamente assistida (PMA) criou um “Admirável mundo novo” 1 em que se concretizam muitos sonhos de parentalidade mas onde emergem importantes questões éticas e socio jurídicas. No universo da fertilização in vitro (FIV) só uma minoria dos muitos embriões criados consegue sobreviver aos riscos biológicos e, se houver criopreservação os nascimentos serão reduzidos em cerca de 10%2. De cada 100 embriões que chegam a ser transferidos nascem em média 15 crianças e 4 são prematuras ou têm problemas perinatais; das 11 restantes, 2 terão alterações do desenvolvimento (Hansen, M., Kurinczuk, J., et al. – 2013). Por lei3, a criopreservação de embriões excedentários está limitada a três anos (excecionalmente seis) período após o qual são destruídos ou utilizados em investigação científica mesmo que se pudessem manter viáveis por períodos maiores (Daniel Serrão – 2003) e que tenderiam a aumentar (Papis K., Lewandowski P., et al. -2013). Face a esta realidade cresce a necessidade duma reflexão multidisciplinar alargada tanto mais que 3,5% das gestações em alguns países e 2,1% dos nascimentos em Portugal4, já são resultado da PMA. Sendo estas técnicas recentes 5 também não se conhecem os seus efeitos a prazo, nem a nível genético ou epigenético (Wennerholm UB, Söderström-Anttila V, Bergh C.et al. -2009). Mesmo subestimando os aspectos morais ou éticos, e privilegiando os recursos pragmáticos que viabilizam vidas humanas, evidenciam-se riscos para o ecossistema em que vivemos e a necessidade de compatibilizar o progresso científico com a salvaguarda dos direitos fundamentais (ONU/1975) 6. No estudo que realizámos sobre neurodesenvolvimento de crianças cujos embriões estiveram criopreservados, avaliámos uma amostra populacional nascida sem problemas neonatais e preenchida pelos «melhores casos» o que nos levou a omitir dos resultados, a dimensão dos riscos da FIV tais como a prematuridade e as suas consequências. Com outra metodologia porém, a comparação das inevitáveis variáveis teria sido impossível num universo tão escasso. Esta investigação situada no âmbito da Bioética e apoiada pela nossa experiência profissional, procurou contribuir para uma demanda científica que é tão fascinante quanto arriscada e que nem sempre respeita o «Primado do embrião humano criado in vivo»7 OBJECTIVO – comparar instrumentalmente o neurodesenvolvimento de crianças cujos embriões foram submetidos a criopreservação com outras social e demograficamente idênticas mas sem esse antecedente, no intuito de promover a reflexão ética e o conhecimento nesta área. MATERIAL E MÉTODOS – Após a seleção da população baseada no modelo das histórias clínicas, definímos os critérios de amostragem e fizemos um estudo de coorte analítico e não-experimental, cujo modelo foi comparativo, correlacional e descritivo. Selecionámos 60 crianças entre os 20 e os 96 meses, com 36 ou mais semanas de idade gestacional (IG) e ausência de patologia perinatal relevante, as quais foram distribuídas por 3 grupos, de acordo com os antecedentes concepcionais: A amostra índex de conveniência, designada Grupo A integrou 19 crianças com criopreservação embrionária nascidas entre janeiro de 2007 e agosto de 2010. Pertencem a um escasso universo de 350 elementos que integra 80 novos casos anuais e onde apenas 260 possuem os critérios de amostragem. O recrutamento foi difícil e exigiu uma vasta rede de contactos incluindo as novas redes digitais. A idade média do Grupo A é 51 meses (L 21- 96). As restantes 41 crianças formaram 2 grupos controle, obtidos de forma tão aleatória quanto possível, num universo mais vasto. O Grupo B tem 22 crianças nascidas entre janeiro de 2006 e outubro de 2012 após FIV com transferência a fresco e com idade média de 56 meses (L 33-85). O Grupo C integrou 19 crianças de concepção natural, nascidas entre maio de 2007 e março de 2012 e idade média de 48 meses (L 20-85). A FIV dos grupos A e B ocorreu em centros portugueses com tecnologia equiparável. Na avaliação neuro cognitiva usámos a metodologia de Ruth Griffiths (EDMG) e o Questionário de Capacidades e de Dificuldades (SDQ-Por) que avalia o comportamento e a socialização8. Os dados das avaliações foram protegidos, informatizados em Excel® e exportados para SPSS 17.0 tendo a sua análise incluído testes paramétricos e não-paramétricos de comparação de grupos e correlações bi-variadas. Só ocasionalmente foi possível uma análise multivariada. Nas variáveis qualitativas utilizou-se o Qui quadrado e na presença de frequências baixas (< 5) utilizou-se o teste exato de Fischer para tabelas de dois por dois, maximizando resultados, sem aumentar descriminações. Um valor de P <0,05 foi indicativo de significado estatístico. Houve crianças com características singulares nos 3 grupos e que não completaram as EDMG aplicadas em condições idênticas pela mesma profissional independente.
- Importância do ensino da bioética nas tecnologias da saúdePublication . Santos, Adelino Manuel Moreira dos; Carvalho, Ana Sofia; Pereira, Sandra MartinsContexto: Não há concordância sobre se programas que visam os maiores tópicos em Bioética são mais ou menos úteis do que aqueles que reconhecem e se focam nas preocupações éticas e morais quotidianas dos profissionais. Neste sentido, tem-se como propósito deste estudo perceber qual a importância do ensino da Bioética/Ética médica no quotidiano profissional dos Técnicos de Saúde. Metodologia: A recolha de dados foi efectuada em plataforma online, durante 40 dias. Ao fim deste período obtivemos 1290 respostas válidas (362 ACSP, 321 RAD e 607 FISIO). Resultados; O questionário (IEB), construído e validado pelos autores, obteve uma consistência interna de 0,96 e uma consistência temporal de 0,95. O IEB apresentou 5 subescalas que avaliam a Intensidade dos Questionamentos Morais, a Frequência dos Questionamentos Morais, a Satisfação com o Trabalho e Envolvimento nas Decisões, a Dificuldade na Reflexão Ética e a Frequência na Reflexão Ética (CMIN/DF=4,924; SRMR=0,093). Os profissionais com formação específica em Bioética estão significativamente mais envolvidos na tomada de decisão ética e apresentam maior intensidade e frequência nos questionamentos morais (p<0,05), embora o tempo de formação não interfira nesta relação. No que diz respeito à formação específica em Deontologia, os profissionais com este tipo de formação, têm significativamente menos dificuldade na reflexão ética e mais dificuldade nos questionamentos morais. Verificouse também que, quanto menos tempo de formação, menor a satisfação e envolvimento na tomada de decisão ética e maior a intensidade e a frequência nos questionamentos morais. Quanto ao número de disciplinas de Bioética/Ética médica verifica-se que influenciam positivamente o envolvimento na tomada de decisão ética, na frequência e na intensidade dos questionamentos morais. Conclusões. Pensamos estar criado um espaço para uma discussão aprofundada da gestão das práticas pedagógicas que permitam aos alunos, futuros profissionais, obter uma maior capacidade para construírem e aplicarem conhecimentos perante as variadas formações para a tomada de decisão ética. Ela passa pela intensidade, frequência e dificuldade que a mesma implica e, daí a necessidade do incremento desta reflexão de forma a incluir os assuntos éticos no quotidiano dos profissionais.
- Measurement uncertainty in screening immunoassays in blood establishmentsPublication . Pereira, Paulo António Rodrigues; Westgard, James O.; Encarnação, PedroNo contexto dos serviços de sangue, a segurança pós‐transfusão do recetor de sangue é considerada um tópico maior. Considerando a segurança dos recetores de sangue, estes serviços deverão testar um conjunto de agentes transmissíveis com prevalência significante na população. O papel dos resultados dos testes de rastreio na validação das dádivas de sangue é crítico para a garantia da segurança pós‐transfusão. Nos países da União Europeia, o rastreio é requerido pela diretiva 2001/83/EC e nos EUA pelas “normas para bancos de sangue e serviços de transfusão”. Dada a incerteza associada aos testes de rastreio, um resultado reportado poderá ser falso. Se um resultado falso positivo não tem consequência para a segurança pós‐transfusão, já um resultado falso negativo tem um grande impacto já que existe uma probabilidade elevada de o recetor do componente sanguíneo ser infetado. Consequentemente, os laboratórios de rastreio devem considerar a avaliação da incerteza de medição nos esquemas de controlo de qualidade. Contudo, os requisitos da União Europeia ou dos EUA relacionados com incerteza são genéricos. Esta tese reúne um conjunto de artigos com discussões acerca de métodos para a determinação da incerteza da medição em imunoensaios de rastreio, assim como de abordagens complementares e modelos de exatidão diagnóstica. A utilização do Guia para a Expressão da Incerteza na Medição (GUM) não é sistemática nos laboratórios de rastreio dos serviços de sangue, tal como noutros laboratórios clínicos. Contudo, têm sido usados nos serviços de sangue outras estimativas de incerteza usando métodos estatísticos. Assim, a discussão reúne, não só modelos de acordo com os princípios do GUM focados na incerteza de resultados próximos ou iguais ao “cutoff” (ponto de decisão clínica), mas também modelos complementares: erro total analítico, período de janela seronegativo e modelo delta para uma estimativa inicial do impacto de resultados incertos no orçamento de um serviço de sangue. Na perspetiva da incerteza diagnóstica reúnem‐se os modelos de exatidão diagnóstica para a determinação da sensibilidade clínica, especificidade clínica e área sob a curva da característica de operação do recetor. Complementariamente, são discutidos modelos para a estimação da concordância de resultados entre testes. Para ilustrar os vários métodos de cálculo foram usados resultados de um imunoensaio quimiluminescente comum para antivírus da hepatite C. Os cálculos mostram incerteza expandida em torno do “cutoff” de 21 a 36 %, tendo sido usado para a estimativa da zona de rejeição [0.70, +[, na qual se registaram somente 0.19 % dos resultados de 9805 amostras. O erro total analítico foi de 23 %. O modelo de período de janela estimou um período seronegativo de 97 dias, considerando a zona de rejeição do imunoensaio. O valor delta indicou que a amostragem de doentes testada no “teste 1” tem uma menor probabilidade para gerar resultados indeterminados, não tendo sido evidenciada uma diferença estatisticamente significativa do “teste 1 e “teste 2” gerarem resultados indeterminados na amostra de não doentes. Os intervalos de confiança a 95 % para a sensibilidade e especificidade clínicas foram, respetivamente, de ICS,95% = [88.3, 100 %] e ICE,95% = [98.5, 100 %], tendo‐se obtido uma área sob a curva da característica de operação do recetor entre 0.99 e 1.00. A concordância total entre os resultados de dois imunoensaios para antivírus da hepatite C foi de 98 a 99 %, tendo sido a concordância entre resultados positivos de 87.9 a 100 % e a concordância entre resultados negativos de 97.8 a 99.9 %. A aplicação do intervalo de confiança a 95 % às estimativas de probabilidades e concordâncias é similar ao conceito de incerteza expandida da incerteza da medição. Todos os métodos apresentados têm aplicação na avaliação da incerteza de medição e incerteza diagnóstica de um imunoensaio, embora tenham condições de utilização diferentes. Recomenda‐se um esquema para a seleção dos modelos para a estimativa da incerteza em laboratórios de rastreio de serviços de sangue, atendendo ao papel de cada modelo na segurança pós‐transfusão.
- Microbial degradation of fluorinated compounds : studies on biodegradation mechanisms and biotreatment systemsPublication . Amorim, Catarina Raquel Leite; Castro, Paula Maria Lima; Afonso, Carlos Manuel Magalhães; Carvalho, Maria de Fátima MagalhãesFluoroorganics are an important class of chemicals compound used in a vast number of applications, including pharmaceutical, agricultural and industrial applications, leading to their disposal and accumulation in the environment. Therefore, it is important to understand and explore the biodegradation mechanisms for their removal. The work described in this thesis aimed to investigate the potential of single bacterial strains for biotransformation of fluoroorganics with different complexity as well as to explore their degradation and fate on biofilm bioreactors. In contaminated environments biodegradation can be affected by different factors. In this study, the effect of different parameters on the biodegradation of fluoroanilines (FAs) by Labrys portucalensis F11 was investigated. Strain F11 was able to degrade FAs as sole source of carbon and nitrogen nevertheless supplementation of the culture medium with nitrogen proved to be beneficial for the degradation. Strain F11 was also able to degrade FAs when cells were previously induced for haloaromatic degradation with fluorobenzene (FB). Indeed, higher removal capacity and substrate degradation rates were achieved using FB-induced cells. Co-metabolism of FAs in the presence of FB was also possible but a competitive mechanism between the substrates for the active sites of the enzymes involved in their degradation occurred. A strain capable of aerobically degrading 4-fluorocinnamic acid (4-FCA), strain S2, was isolated from a biofilm bioreactor and identified as belonging to the genus Rhodococcus. Strain S2 was able to mineralize 4-FCA as a sole carbon source but the presence of an easy degradable carbon source in the culture medium allowed a faster 4-FCA removal. However, 4-FCA concentrations higher than 1 mM led to a decrease in cell growth rate and in substrate degradation rate, indicating a toxic effect of this compound on S2 cells. A metabolic pathway for the degradation of 4-FCA by strain S2 is proposed on the basis of the identified intermediates. 4-Fluorobenzoate (4-FBA) was the major transient accumulated intermediate and for the first time trans, trans-muconate was reported as an intermediate in a biodegradation pathway. Biological degradation of 4-FCA in rotating biological contactor (RBC) was studied. After development of a stable biofilm, 35 mg L-1 of 4-FCA was intermittently fed to the bioreactor during 2 months, however only limited mineralization occurred. Therefore, the RBC was inoculated with a suspended culture of strain S2 in order to enhance the reactor performance. After bioaugmentation mineralization of 4-FCA was achieved however, a decrease in 4-FCA removal along bioreactor operation was observed. Apart from strain S2, two other 4-FCA degrading strains were isolated from the biofilm. After bioaugmentation, the degraders remained in the bioreactor by the end of the experiment but the intermittent feeding of the target compound probably led to lower cell numbers. Nevertheless, the study reinforced the need of bioaugmentation when dealing with recalcitrant compounds. Fluoroquinolones (FQs) are fluorinated antibiotics, which contamination and persistence in several environmental matrices have been well documented in the past years. Labrys portucalensis was capable to degrade the selected FQs, namely ofloxacin, norfloxacin and ciprofloxacin, when supplied individually or as a mixture, in the presence of an easy degradable carbon source. For concentrations of FQs higher than 3.5 μM an inhibitory effect on growth of the strain was observed. The removal capacity of strain F11 also decreased at high FQ concentration and stoichiometric fluoride release was not achieved. Several intermediates were identified from the degradation of each FQ and the piperazine ring and the fluorine substituent seemed to be the targets of the enzymatic attack. A granular sludge sequencing batch reactor (SBR), established with activated sludge from a wastewater treatment plant (WWTP), was operated for the treatment of an aqueous stream containing FQs. The effects of FQs on different biological processes, such as Chemical Oxygen Demand (COD), nitrogen and phosphorous removal by aerobic granular sludge were investigated. Overall, no significant alterations on COD effluent levels were registered. Nitrifiers present in the granular sludge were not affected by the presence of FQs however the activity of denitrifiers and phosphate accumulating organisms (PAO) seemed to be inhibited. Sorption and desorption of FQs onto aerobic granules occurred. During reactor operation the microbial community dynamics was monitored by plating the biofilm and by 16S DGGE. Shifts in the microbial communities due to FQs exposure were observed, however some bacteria seemed to be resistant to the selective pressure exerted by the antibiotics.
- Novel approaches on the characterization of the wastewater resistome : possible implications on human health and water quality managementPublication . Rocha, Jaqueline Maria Matias da; Rodrigues, Célia Maria Manaia; Henriques, Isabel da Silva; Ribas, Margarita GomilaAntibiotic resistant bacteria and antibiotic resistance genes are considered contaminants of emerging concern, nowadays widely disseminated in the environment. Urban wastewater treatment plants are major recipients and reservoirs for these contaminants. In urban these plants, wastewater is subjected to different types of treatment that reduce the levels of antibiotic resistant bacteria and antibiotic resistance genes, although not completely. Considering that most of the bacteria are not culturable and that this fraction might harbor antibiotic resistance genes, culture-independent methods are currently used to assess antibiotic resistance in the environment. Among these methods, quantitative PCR is considered the gold standard used to quantify antibiotic resistance genes in environmental samples, although the lack of harmonized methods seriously limits the reliable comparison of results obtained in different laboratories. Among the antibiotic resistant bacteria emitted by wastewater treatment plants, Enterobacteriaceae represent an important fraction and among these Klebsiella pneumoniae deserve special attention. Indeed, K. pneumoniae is a bacterial species that besides the clinical importance when associated to humans, can also be found in the environment, in soils, plants, water, and wastewater. The capacity of this bacterial species to thrive in different environments and in humans and animals increases its significance in terms of human health threat might constitute a human health threat. However, the traits that might be maintained or lost during the transit of K. pneumoniae through clinical and environmental contexts are still unknown. This thesis aimed to 1) advance the knowledge regarding the use of harmonized analytical quantitative PCR methods that might enable reliable comparisons of genes quantification ; 2) design a cell-based internal standard that could be used in different laboratories to assess losses during water samples filtration, DNA extraction and quantitative PCR quantification; and 3) contribute to a better understanding of the ecology of K. pneumoniae and infer about possible dynamics between clinic and environmental niches, with special focus on genetic diversity and antibiotic resistance stability. To tackle the first aim, genetic determinants encoding resistance to sulfonamides (sul1 and sul2), quinolones (qnrS), and β-lactams (blaTEM) and the 16S rRNA gene were monitored in DNA extracts supplied by partners who were investigating wastewater treatment processes, at full- or pilot-scale. In parallel, the influence on genes quantification of DNA shipment, quantitative PCR protocols, standards and equipment was studied in an interlaboratory comparison. These results and the literature available justified the efforts to meet the second aim. An internal standard, consisting in a cloned gene fragment not found in wastewater samples was designed and tested. This internal standard is to be used to spike wastewater or water samples aiming to control DNA losses during the processing of the sample and DNA extraction process. The emission of antibiotic resistant bacteria by wastewater treatment plants is an issue of concern, however it is not clear if these bacteria will survive and maintain their features once in the environment. To investigate this topic, K. pneumoniae was used as a model species and two distinct research approaches were used. A group of 3 rd generation cephalosporin-resistant K. pneumoniae isolates (25 wastewater; 34 clinical) was compared based on phenotypic, genotypic and genomic analyses (n=22) and a broader group of genomes collected from a public database (21 countries, 61 environmental; 78 clinical) was compared based on a core and pangenome approach and profiles of antibiotic and metal resistance, virulence, efflux systems, oxidative stress and quorum sensing traits. According to the results obtained and their analysis, it was concluded that wastewater treatment efficiency and wastewater quality regarding antibiotic resistance emissions should always be measured based on absolute abundance (per volume), rather than in relative abundance (per total bacteria). The interlaboratory comparison seemed to be reliable, although DNA extract quality and stability during shipment, as well as consumables and equipment specificities, may be critical for the monitoring findings. The use of a cell-based internal standard may contribute to overcome those limitations. This internal standard permitted to estimate the water matrix effect which was associated with an underestimation that ranged 0.1–0.9 log gene copy number mL−1 of sample, irrespective of the water type. Clinical and wastewater isolates were indistinguishable based on phenotypic and genotypic characterization, although distinct lineages may prevail in clinical or environmental settings. Genetic determinants related to efflux, oxidative stress or quorum sensing functions were common to clinical and wastewater isolates, while antibiotic and metal resistance or virulence genes, were variable across the genomes and associated with mobile genetic elements, mostly transposons, insertion sequences or integrative and conjugative elements. The analysis of a larger and geographically more diverse group of genomes, suggested that antibiotic and metal resistance and virulence gene alleles were more prevalent and diverse in clinical isolates, while some quorum sensing, efflux systems and oxidative stress genetic determinants alleles were more prevalent and diverse in environmental isolates. The studies performed unveil a promising opportunity to implement comparable and reliable antibiotic resistance monitoring schemes. The harmonization of some procedures and the use of internal standards will enable worldwide comparisons of antibiotic resistance genes in wastewaters, and therefore improve and promote surveillance studies worldwide. The double evidence that antibiotic resistance features observed in clinical K. pneumoniae are maintained in the environment and that it is among the environmental isolates that stress dwelling features seem to be more diverse, supports the high capacity of K. pneumoniae for spreading through wastewater or in the environment, enhancing the risks of transmission back to humans.
- Perfil de competências éticas para gerir unidades de saúde hospitalaresPublication . Silva, Amélia da Conceição Rego da; Serrão, Daniel; Araújo, BeatrizA eticidade diz respeito à aptidão para exercer a função ética, atuando em sintonia com os princípios e valores preconizados pela ética, sobretudo o respeito pela pessoa humana. Esta dissertação intitulada Perfil de competências éticas para gerir Unidades de Saúde Hospitalares emerge da perceção de que existem desigualdades na garantia dos direitos de acesso aos cuidados de saúde, com universalidade e equidade, motivadas pelas restrições de natureza económica. A investigação aborda a interface de duas áreas - Bioética e Gestão -, no contexto dos cuidados de saúde, especificamente nos hospitais. Espera-se que contribua para identificar a base axiológica sobre a qual se devem apoiar os gestores em saúde, operacionalizar um perfil de competências éticas para gerir hospitais com vinculação a valores e encontrar resposta à questão: o sistema de valores humanos e a ética dos gestores hospitalares influencia a decisão? A conceção e a relevância do estudo advêm do facto de a pesquisa em bases de dados ter demonstrado carência de estudos relacionados com a ética da gestão em saúde. Esta lacuna de investigação, o âmbito e os objetivos do estudo, tornam-no de clara pertinência no atual contexto social, político e do Setor da Saúde. A pesquisa adota metodologia quanti qualitativa, de tipo correlacional, valendo-se da aplicação do questionário Eticidade da Gestão Hospitalar, por nós construído e validado, para proceder à avaliação do agir ético do gestor hospitalar, identificando o perfil de competências éticas necessárias para gerir Unidades de Saúde hospitalares. A metodologia qualitativa utiliza pesquisa documental e a análise de conteúdo incidiu sobre o texto relacionado com missão, valores e visão dos hospitais, disponível na Internet. A amostra é constituída por 421 profissionais de saúde, que exercem funções de gestão em 25 hospitais do Serviço Nacional de Saúde e hospitais convencionados, da Zona Norte de Portugal, independentemente do modelo de gestão e representativos dos setores público, privado e social. Os resultados encontrados afirmam que os profissionais de saúde, além da consideração da perspetiva filosófica das pessoas, respeitam a sua multidimensionalidade complexa reconhecendo a singularidade e a individualidade pessoal, social e cultural. Com base no modelo de análise construído e nos dados do estudo empírico, este estudo conclui que os gestores dos hospitais analisados integraram as orientações inseridas no código deontológico do seu grupo profissional e possuem um quadro de competências éticas, agindo referenciados pelo paradigma ético do personalismo.
- Tracking antibiotic resistance from hospital effluents to the surrouding environmentPublication . Varela, Ana Rita Boura; Rodrigues, Célia Maria Manaia; Nunes, Olga Cristina PastorNas últimas décadas, o papel do ambiente na disseminação de resistência a antibióticos de relevância clínica tem recebido especial atenção. Neste âmbito, as águas residuais hospitalares e municipais, onde resíduos de antibióticos e bactérias resistentes são descarregados, estão entre os mais importantes reservatórios ambientais. Porém, o seu papel na disseminação da resistência ainda está pouco compreendido. O principal objectivo deste estudo foi o de avaliar a relevância dos efluentes hospitalares na disseminação de bactérias resistentes a antibióticos e de genes de resistência no ambiente. O estudo focou-se num efluente hospitalar e nas águas residuais da estação de tratamento receptora (ETAR). Através da análise multivariada baseada nas variações da composição das comunidades bacterianas e das populações resistentes a antibióticos cultiváveis em função das variações da concentração de resíduos de antibióticos e metais, procurou-se compreender como se interligam estas variáveis. As correlações positivas significativas observadas sugeriram que a presença dos contaminantes químicos analisados poderia estar associada a rearranjos nas comunidades bacterianas ou à selecção de populações resistentes em águas residuais, principalmente em efluentes hospitalares. O potencial das águas residuais hospitalares e municipais como reservatórios de resistência a antibióticos foi de seguida investigado, usando como modelo membros da espécie Escherichia coli resistentes a quinolonas. Foi seleccionado um grupo de estirpes de E.coli resistentes a quinolonas, representativo de amostragens de águas residuais municipais e de ribeiras urbanas abrangendo um período de nove anos. A diversidade genética destes isolados foi avaliada com base em multilocus sequence typing (MLST), e esta informação foi comparada com dados dos isolados sobre a presença de determinantes genéticos associados com resistência a quinolonas e com outras características associadas a resistência. Assim, foi possível inferir sobre a ocorrência de disseminação vertical e/ou horizontal de resistência. A análise baseada em MLST demonstrou que isolados de diferentes tipos de água e datas de isolamento se agrupavam, sugerindo não só o carácter ubiquista de algumas linhagens, mas também a sua persistência em ambientes aquáticos. A indicação de disseminação vertical de resistência sugerida por estes dados foi confirmada pelo facto de que a resistência a quinolonas era essencialmente de base cromossómica. Apesar disso, a presença dos mesmos determinantes adquiridos de resistência a quinolonas e beta-lactâmicos e de replicões plasmídicos em E.coli de diferentes linhagens e origens sugeriu que estas bactérias têm um papel importante na transferência horizontal da resistência em ambientes aquáticos. Esta ideia foi reforçada pela observação de que alguns destes determinantes se encontravam em elementos genéticos conjugativos. Nesta fase, a questão era se as mesmas linhagens e genes encontrados em E.coli de ambientes aquáticos ocorriam em outros habitats. A mesma abordagem aplicada a um grupo alargado de isolados de origens diferentes mostrou que as mesmas linhagens podiam ser encontradas em pacientes hospitalares e em gaivotas, mas não em aves de rapina de uma reserva natural, sugerindo que algumas linhagens de E.coli podem ser disseminadas entre ambientes com influência humana. Sendo E.coli uma espécie comensal em animais e humanos, o estudo de um grupo bacteriano ambiental não associado com humanos era também de interesse. A escolha recaiu sobre o género Aeromonas e, numa perspectiva de continuidade com o trabalho prévio, foram seleccionadas estirpes resistentes a quinolonas. Surpreendentemente, apesar da fraca associação com humanos, observou-se que entre as Aeromonas spp. de efluente hospitalar se encontrava uma prevalência de resistência a antibióticos superior às da ETAR. O papel desta espécie como vector de disseminação de resistência foi evidenciado de várias formas. Primeiro, foi possível identificar em Aeromonas spp. do efluente hospitalar um gene de beta-lactamase previamente não descrito em Aeromonas spp. nem fora do contexto clínico. Segundo, viu-se que possuíam dois genes de resistência adquirida a quinolonas, um claramente ubíquo e outro de origem não clínica, o que pode ser interessante em estudos de fontes de dispersão de resistência. Terceiro, alguns dos genes de resistência a antibióticos podiam ser transferidos para E.coli por conjugação. Confirmou-se que Aeromonas spp. podem ser veículos relevantes de resistência, e que o hospital pode ser uma fonte importante de membros deste género. A transferência horizontal de genes por conjugação e o efeito de concentrações subinibitórias de antibióticos são temas chave para a compreensão da disseminação da resistência a antibióticos. Este tema foi investigado com base numa estirpe multiresistente de E.coli de efluente hospitalar. Observou-se que enquanto uma concentração subinibitória de ceftazidime aumentava significativamente a taxa de conjugação, tetraciclina produzia o efeito oposto. O plasmidoma conjugativo, que em média foi transferido em mais de 90% dos ensaios, incluía possíveis determinantes de persistência, de resistência a antibióticos e a metais, sugerindo a importância de fenómenos de co-selecção. Confirmou-se portanto que o efluente hospitalar é uma fonte relevante de bactérias resistentes a antibióticos e de determinantes de resistência para o ambiente.