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Authors
Abstract(s)
Fluoroorganics are an important class of chemicals compound used in a vast number of
applications, including pharmaceutical, agricultural and industrial applications, leading to
their disposal and accumulation in the environment. Therefore, it is important to
understand and explore the biodegradation mechanisms for their removal. The work
described in this thesis aimed to investigate the potential of single bacterial strains for
biotransformation of fluoroorganics with different complexity as well as to explore their
degradation and fate on biofilm bioreactors.
In contaminated environments biodegradation can be affected by different factors. In this
study, the effect of different parameters on the biodegradation of fluoroanilines (FAs) by
Labrys portucalensis F11 was investigated. Strain F11 was able to degrade FAs as sole
source of carbon and nitrogen nevertheless supplementation of the culture medium with
nitrogen proved to be beneficial for the degradation. Strain F11 was also able to degrade
FAs when cells were previously induced for haloaromatic degradation with fluorobenzene
(FB). Indeed, higher removal capacity and substrate degradation rates were achieved using
FB-induced cells. Co-metabolism of FAs in the presence of FB was also possible but a
competitive mechanism between the substrates for the active sites of the enzymes
involved in their degradation occurred.
A strain capable of aerobically degrading 4-fluorocinnamic acid (4-FCA), strain S2, was
isolated from a biofilm bioreactor and identified as belonging to the genus Rhodococcus.
Strain S2 was able to mineralize 4-FCA as a sole carbon source but the presence of an easy
degradable carbon source in the culture medium allowed a faster 4-FCA removal. However,
4-FCA concentrations higher than 1 mM led to a decrease in cell growth rate and in
substrate degradation rate, indicating a toxic effect of this compound on S2 cells. A
metabolic pathway for the degradation of 4-FCA by strain S2 is proposed on the basis of the
identified intermediates. 4-Fluorobenzoate (4-FBA) was the major transient accumulated
intermediate and for the first time trans, trans-muconate was reported as an intermediate
in a biodegradation pathway.
Biological degradation of 4-FCA in rotating biological contactor (RBC) was studied. After
development of a stable biofilm, 35 mg L-1 of 4-FCA was intermittently fed to the bioreactor
during 2 months, however only limited mineralization occurred. Therefore, the RBC was
inoculated with a suspended culture of strain S2 in order to enhance the reactor performance. After bioaugmentation mineralization of 4-FCA was achieved however, a
decrease in 4-FCA removal along bioreactor operation was observed. Apart from strain S2,
two other 4-FCA degrading strains were isolated from the biofilm. After bioaugmentation,
the degraders remained in the bioreactor by the end of the experiment but the intermittent
feeding of the target compound probably led to lower cell numbers. Nevertheless, the
study reinforced the need of bioaugmentation when dealing with recalcitrant compounds.
Fluoroquinolones (FQs) are fluorinated antibiotics, which contamination and persistence in
several environmental matrices have been well documented in the past years. Labrys
portucalensis was capable to degrade the selected FQs, namely ofloxacin, norfloxacin and
ciprofloxacin, when supplied individually or as a mixture, in the presence of an easy
degradable carbon source. For concentrations of FQs higher than 3.5 μM an inhibitory
effect on growth of the strain was observed. The removal capacity of strain F11 also
decreased at high FQ concentration and stoichiometric fluoride release was not achieved.
Several intermediates were identified from the degradation of each FQ and the piperazine
ring and the fluorine substituent seemed to be the targets of the enzymatic attack.
A granular sludge sequencing batch reactor (SBR), established with activated sludge from a
wastewater treatment plant (WWTP), was operated for the treatment of an aqueous
stream containing FQs. The effects of FQs on different biological processes, such as
Chemical Oxygen Demand (COD), nitrogen and phosphorous removal by aerobic granular
sludge were investigated. Overall, no significant alterations on COD effluent levels were
registered. Nitrifiers present in the granular sludge were not affected by the presence of
FQs however the activity of denitrifiers and phosphate accumulating organisms (PAO)
seemed to be inhibited. Sorption and desorption of FQs onto aerobic granules occurred.
During reactor operation the microbial community dynamics was monitored by plating the
biofilm and by 16S DGGE. Shifts in the microbial communities due to FQs exposure were
observed, however some bacteria seemed to be resistant to the selective pressure exerted
by the antibiotics.
Os compostos fluoorgânicos são uma importante classe de compostos químicos utilizados num grande número de aplicações a nível farmacêutico, agrícola e industrial, e ocorrendo a sua deposição e acumulação no ambiente. Como tal, torna-se relevante compreender e explorar os mecanismos de biodegradação destes compostos. O trabalho descrito nesta tese tem como objectivo investigar o potencial de estirpes bacterianas na biotransformação de compostos fluoroorgânicos de diferente complexidade, bem como explorar a remoção desses mesmos compostos em reactores de biofilme. Um processo de biodegradação pode ser influenciado por diferentes factores. Neste estudo, foi investigada a bioiodegradação de fluoroanilinas (FAs) pela estirpe bacteriana Labrys portucalensis F11, conhecida plea sua capacidade metabólica de degradar compostos fluorados. A estirpe F11 mostrou ser capaz de degradar FAs como única fonte de fonte de carbono e azoto no entanto, a adição de uma fonte de azoto ao meio de cultura provou ser benéfica para a degradação. A remoção de FAs pela estirpe F11 com células previamente induzidas para a degradação de compostos halogenados com fluorobenzeno (FB) levou a um aumento da capacidade de remoção e das taxas de remoção do substrato. A degradação de FAs em co-metabolismo com FB foi também observada contudo verificouse a ocorrência de mecanismos de competição entre os substratos para o sítio activo das enzimas envolvidas na degradação. Uma estirpe capaz de degradar ácido 4-fluorocinâmico (4-FCA) em condições aeróbias, (estirpe S2) foi isolada de um bioreactor de biofilme e identificada como pertencendo ao género Rhodococcus. A estirpe S2 mostrou ser capaz de mineralizar 4-FCA como única fonte de carbono, mas a presença de uma fonte de carbono facilmente degradável no meio de cultura acelerou a remoção de 4-FCA. No entanto, concentrações de 4-FCA superiores a 1 mM levaram a uma diminuição da taxa de crescimento celular e da taxa de degradação, demonstrando o efeito tóxico deste composto. A via metabólica de degradação de 4-FCA foi proposta com base nos intermediários identificados. O metabolito 4-fluorobenzoato (4- FBA) foi aquele que se acumulou em maior quantidade e, pela primeira vez o metabolito trans, trans-muconate foi reportado como intermediário numa via de biodegradação. A degradação biológica de 4-FCA num reactor de biodiscos (RBC) foi também estudada. Após o desenvolvimento de um biofilme estável, o reactor foi intermitentemente alimentado com 35 mg L-1 de 4-FCA durante dois meses, no entanto, a mineralização do composto foi diminuta. Deste modo, o RBC foi inoculado com uma cultura da estirpe isolada S2 de forma a melhorar o desempenho do reactor. Após bioaumento a mineralização de 4-FCA foi alcançada mas observou-se uma diminuição na capacidade de degradação de 4-FCA ao longo do tempo de operação do reactor. Para além da estirpe S2, duas outras estirpes capazes de degradar 4-FCA foram isoladas do biofilme. Após o bioaumento, as estirpes degradadoras permaneceram no reactor até ao final da experiência, mas a alimentação intermitente com 4-FCA levou provavelmente a uma diminuição do número de células. No entanto, o estudo reforçou a ideia de que a estratégia de bioaumento é necessária quando se pretende remover compostos recalcitrantes. As fluoroquinolonas (FQs) são antibióticos fluorados, cuja contaminação e persistência em várias matrizes ambientais têm sido bem documentada. A estirpe Labrys portucalensis foi capaz de degradar as FQs seleccionadas, nomeadamente, ofloxacina, ciprofloxacina e norfloxacina, quando facultadas individualmente ou como uma mistura, na presença de uma fonte de carbono facilmente degradável. Para concentrações de FQs superiores a 3.5 μM foi observado um efeito inibitório no crescimento celular e na capacidade de remoção. A libertação estequiométrica de ião fluoreto nunca foi observada. Vários intermediários foram identificados a partir da degradação de cada FQ e, o anel de piperazina e o átomo de fluor da molécula parecem ser os principais alvos de ataque enzimático. Um reactor granular sequencial em batch (SBR), estabelecido com lamas activadas de uma estação de tratamento de águas residuais (WWTP), foi operado para o tratamento de uma corrente aquosa contendo FQs. Os efeitos da FQs em diferentes processos biológicos, tais como a carência química de oxigénio (CQO), a remoção de azoto e remoção de fósforo foram investigados. De uma forma geral não foram registradas alterações significativas nos níveis de COD do efluente. As bactérias nitrificantes presentes nos grânulos não foram afectadas pela presença de FQs mas, a actividade das bactérias denitrificantes e organismos acumuladores de fosfato parece ser inibida. Foi observada adsorção e desadsorção de FQs aos grânulos aeróbicos. Durante a operação do reactor a dinâmica da comunidade microbiana presente nos grânulos aeróbios foi avaliada por electroforese em gel de gradiente desnaturante e por plaqueamento do biofilme. Foram observadas alterações na comunidade microbiana devido à exposição às FQs, no entanto, algumas bactérias parecem ser resistentes à pressão selectiva exercida pelos antibióticos.
Os compostos fluoorgânicos são uma importante classe de compostos químicos utilizados num grande número de aplicações a nível farmacêutico, agrícola e industrial, e ocorrendo a sua deposição e acumulação no ambiente. Como tal, torna-se relevante compreender e explorar os mecanismos de biodegradação destes compostos. O trabalho descrito nesta tese tem como objectivo investigar o potencial de estirpes bacterianas na biotransformação de compostos fluoroorgânicos de diferente complexidade, bem como explorar a remoção desses mesmos compostos em reactores de biofilme. Um processo de biodegradação pode ser influenciado por diferentes factores. Neste estudo, foi investigada a bioiodegradação de fluoroanilinas (FAs) pela estirpe bacteriana Labrys portucalensis F11, conhecida plea sua capacidade metabólica de degradar compostos fluorados. A estirpe F11 mostrou ser capaz de degradar FAs como única fonte de fonte de carbono e azoto no entanto, a adição de uma fonte de azoto ao meio de cultura provou ser benéfica para a degradação. A remoção de FAs pela estirpe F11 com células previamente induzidas para a degradação de compostos halogenados com fluorobenzeno (FB) levou a um aumento da capacidade de remoção e das taxas de remoção do substrato. A degradação de FAs em co-metabolismo com FB foi também observada contudo verificouse a ocorrência de mecanismos de competição entre os substratos para o sítio activo das enzimas envolvidas na degradação. Uma estirpe capaz de degradar ácido 4-fluorocinâmico (4-FCA) em condições aeróbias, (estirpe S2) foi isolada de um bioreactor de biofilme e identificada como pertencendo ao género Rhodococcus. A estirpe S2 mostrou ser capaz de mineralizar 4-FCA como única fonte de carbono, mas a presença de uma fonte de carbono facilmente degradável no meio de cultura acelerou a remoção de 4-FCA. No entanto, concentrações de 4-FCA superiores a 1 mM levaram a uma diminuição da taxa de crescimento celular e da taxa de degradação, demonstrando o efeito tóxico deste composto. A via metabólica de degradação de 4-FCA foi proposta com base nos intermediários identificados. O metabolito 4-fluorobenzoato (4- FBA) foi aquele que se acumulou em maior quantidade e, pela primeira vez o metabolito trans, trans-muconate foi reportado como intermediário numa via de biodegradação. A degradação biológica de 4-FCA num reactor de biodiscos (RBC) foi também estudada. Após o desenvolvimento de um biofilme estável, o reactor foi intermitentemente alimentado com 35 mg L-1 de 4-FCA durante dois meses, no entanto, a mineralização do composto foi diminuta. Deste modo, o RBC foi inoculado com uma cultura da estirpe isolada S2 de forma a melhorar o desempenho do reactor. Após bioaumento a mineralização de 4-FCA foi alcançada mas observou-se uma diminuição na capacidade de degradação de 4-FCA ao longo do tempo de operação do reactor. Para além da estirpe S2, duas outras estirpes capazes de degradar 4-FCA foram isoladas do biofilme. Após o bioaumento, as estirpes degradadoras permaneceram no reactor até ao final da experiência, mas a alimentação intermitente com 4-FCA levou provavelmente a uma diminuição do número de células. No entanto, o estudo reforçou a ideia de que a estratégia de bioaumento é necessária quando se pretende remover compostos recalcitrantes. As fluoroquinolonas (FQs) são antibióticos fluorados, cuja contaminação e persistência em várias matrizes ambientais têm sido bem documentada. A estirpe Labrys portucalensis foi capaz de degradar as FQs seleccionadas, nomeadamente, ofloxacina, ciprofloxacina e norfloxacina, quando facultadas individualmente ou como uma mistura, na presença de uma fonte de carbono facilmente degradável. Para concentrações de FQs superiores a 3.5 μM foi observado um efeito inibitório no crescimento celular e na capacidade de remoção. A libertação estequiométrica de ião fluoreto nunca foi observada. Vários intermediários foram identificados a partir da degradação de cada FQ e, o anel de piperazina e o átomo de fluor da molécula parecem ser os principais alvos de ataque enzimático. Um reactor granular sequencial em batch (SBR), estabelecido com lamas activadas de uma estação de tratamento de águas residuais (WWTP), foi operado para o tratamento de uma corrente aquosa contendo FQs. Os efeitos da FQs em diferentes processos biológicos, tais como a carência química de oxigénio (CQO), a remoção de azoto e remoção de fósforo foram investigados. De uma forma geral não foram registradas alterações significativas nos níveis de COD do efluente. As bactérias nitrificantes presentes nos grânulos não foram afectadas pela presença de FQs mas, a actividade das bactérias denitrificantes e organismos acumuladores de fosfato parece ser inibida. Foi observada adsorção e desadsorção de FQs aos grânulos aeróbicos. Durante a operação do reactor a dinâmica da comunidade microbiana presente nos grânulos aeróbios foi avaliada por electroforese em gel de gradiente desnaturante e por plaqueamento do biofilme. Foram observadas alterações na comunidade microbiana devido à exposição às FQs, no entanto, algumas bactérias parecem ser resistentes à pressão selectiva exercida pelos antibióticos.