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Publication
Surveillance of zoonotic and non-zoonotic bovine viruses circulating among cattle in Catalonia and characterization of their excreted virome
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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Zoonotic and non-zoonotic viruses with veterinarian interest can enter the environment through different routes, depending on its shedding mechanism, being able to infect other animals and humans continuously. Following the concept of One-health, it’s important to enhance preparedness and early warning of possible viral outbreaks, with potential to jeopardize the lives of animals and humans while maintaining the environment sustainability. The goal of this work was to study the potential of using collective environmental samples to detect viruses of veterinarian interest and/or with zoonotic potential, circulating among cattle, reducing the need for the collection of individual clinical samples that require the use of invasive methods in the animals. In addition, new SOPs for n(RT)PCRs and (RT)qPCRs to detect these viruses were implemented in the laboratory. Between May and June of 2023, individual saliva and faeces samples together with collective samples such as drinking water and bed straw were collected in 4 cattle farms to compare the detection by (RT)qPCR of selected viruses. These samples were analysed to optimize the methods used in this study. A sampling campaign of collective samples was implemented: 16 lixiviates and 16 aerosol samples from 2 cattle farms were collected from September to April 2023-2024 and 8 wastewater samples from 2 cattle slaughterhouses were collected between February and April 2024. For viral detection, all the collective samples were submitted to a viral concentration procedure followed by nucleic acid extraction. Samples were tested for several bovine viruses by (RT)qPCR: BPyV, RoV-A, BCoV, BRSV, CCHFV, EHDV, BTV and AIV. BPyV seemed to be a good bovine viral marker in lixiviate samples (13 /15) but not in clinical samples (2/99) nor in wastewater samples from slaughterhouses (5/8 with very low concentrations). Overall, RoV-A was detected in 31,25% of the lixiviates from the cow farms and in 75% of the wastewater samples from slaughterhouses and BCoV was detected in both lixiviates and aerosol samples and it was present in 50% of the samples of Sabadell slaughterhouse, proving the circulation of the virus among cattle in Catalonia. The viruses AIV, CCHFV, BRSV, EHDV and BTV weren’t detected in any of the individual and collective samples tested by (RT)qPCR. A nested (RT)PCR for the detection of EHDV (targeting mainly the serotypes 6 and 8) was developed “in house” and it showed to be efficient for concentrations as low as 250GC/rx in biological samples. Furthermore, NGS was performed on the collective environmental samples using an Illumina NextSeq 550 platform coupled with a target enrichment to characterize the virome. The NGS enabled the detection of 16 viral genus related to bovine infection. Other non-bovine viruses were also detected in collective samples including viruses not detected by (RT)qPCR techniques, such as BRSV and BPyV in aerosols. However, the method showed difficulties in capturing dsRNA genomes, as the case of RoV-A, detected in high amounts by (RT)qPCR. In this work, the use of collective environmental samples revealed to be suitable for surveillance of viruses circulating in cattle industry, suggesting it’s potential use as an early detection tool of viral outbreaks of veterinary interest in the cows’ population, or to monitor the circulation of viruses with zoonotic potential.
Vírus zoonóticos e não zoonóticos de interesse veterinário podem chegar ao ambiente por diversas vias, dependendo do seu mecanismo de excreção, sendo capazes de infetar outros animais e humanos continuamente. Segundo o conceito da “One-health”, é importante melhorar a preparação e alerta precoce de possíveis surtos, com potencial para prejudicarem vidas animais e humanas, mantendo a sustentabilidade ambiental. O objetivo deste trabalho era estudar o potencial do uso de amostras ambientais coletivas para a deteção de vírus de interesse veterinário e/ou com potencial zoonótico em circulação entre gado, reduzindo a necessidade da coleta de amostras clínicas que requerem o uso de métodos invasivos nos animais. Adicionalmente, novos protocolos operacionais standardizados para n(RT)PCR e (RT)qPCR foram implementados no laboratório. Entre maio e junho de 2023, amostras individuais de saliva e fezes em conjunto com amostras coletivas de água potável e palha foram coletadas em 4 quintas de gado para comparar a deteção por (RT)qPCR de vírus selecionados. Estas amostras foram analisadas para otimizar os métodos usados ao longo do trabalho. Uma campanha de amostragem de amostras coletivas foi implementada: 16 lixiviados e 16 aerossóis de 2 quintas de gado foram coletados desde setembro de 2023 até abril de 2024 e 8 amostras de água residual de 2 matadouros de gado foram coletadas entre fevereiro e abril de 2024. Para a deteção viral, todas as amostras coletivas foram submetidas a um procedimento de concentração viral seguido da extração de ácidos nucleicos. As amostras foram testadas para vários vírus bovinos por (RT)qPCR: BPyV, RoV-A, BCoV, BRSV, CCHFV, EHDV, BTV e AIV. O BPyV pareceu ser um bom indicador viral bovino em amostras de lixiviados (13/15) mas não em amostras clínicas (2/99) nem em amostras de água residual de matadouros (5/8, com baixas concentrações). No geral, o RoV-A foi detetado em 31,25% dos lixiviados das quintas e em 75% das amostras de águas residuais dos matadouros e o BCoV foi detetado em amostras de lixiviados e de aerossóis e estava presente em 50% das amostras do matadouro de Sabadell, provando a circulação do vírus em gado na Catalunha. Os vírus AIV, CCHFV, BRSV, EHDV e BTV não foram detetados em nenhuma das amostras individuais e coletivas testadas por (RT)qPCR. Um n(RT)PCR para a deteção do EHDV (com alvo principal nos serotipos 6 e 8) foi desenvolvido no laboratório e mostrou ser eficiente para concentrações tão baixas como 250 GC/rx em amostras biológicas. Para além disso, NGS foi realizado nas amostras ambientais coletivas usando uma plataforma Illumina NextSeq 550 acoplada com enriquecimento do alvo para a caracterização do viroma de gado. O NGS permitiu a deteção de 16 genes virais relacionados com infeções bovinas. Outros vírus não bovinos foram também detetados nas amostras coletivas, incluindo vírus não detetados por (RT)qPCR, como BRSV e BPyV em aerossóis. Contudo, o método mostrou algumas dificuldades em capturar genomas de cadeia dupla de RNA, como é o caso do RoV-A, detetado em grandes quantidades por (RT)qPCR. Neste trabalho, o uso de amostras ambientais coletivas revelou-se apropriado para a vigilância de vírus em circulação na indústria de gado, sugerindo o seu potencial uso como uma ferramenta de deteção precoce de surtos virais de interesse veterinário na população de vacas, ou para monitorizar a circulação de vírus potencialmente zoonóticos.
Vírus zoonóticos e não zoonóticos de interesse veterinário podem chegar ao ambiente por diversas vias, dependendo do seu mecanismo de excreção, sendo capazes de infetar outros animais e humanos continuamente. Segundo o conceito da “One-health”, é importante melhorar a preparação e alerta precoce de possíveis surtos, com potencial para prejudicarem vidas animais e humanas, mantendo a sustentabilidade ambiental. O objetivo deste trabalho era estudar o potencial do uso de amostras ambientais coletivas para a deteção de vírus de interesse veterinário e/ou com potencial zoonótico em circulação entre gado, reduzindo a necessidade da coleta de amostras clínicas que requerem o uso de métodos invasivos nos animais. Adicionalmente, novos protocolos operacionais standardizados para n(RT)PCR e (RT)qPCR foram implementados no laboratório. Entre maio e junho de 2023, amostras individuais de saliva e fezes em conjunto com amostras coletivas de água potável e palha foram coletadas em 4 quintas de gado para comparar a deteção por (RT)qPCR de vírus selecionados. Estas amostras foram analisadas para otimizar os métodos usados ao longo do trabalho. Uma campanha de amostragem de amostras coletivas foi implementada: 16 lixiviados e 16 aerossóis de 2 quintas de gado foram coletados desde setembro de 2023 até abril de 2024 e 8 amostras de água residual de 2 matadouros de gado foram coletadas entre fevereiro e abril de 2024. Para a deteção viral, todas as amostras coletivas foram submetidas a um procedimento de concentração viral seguido da extração de ácidos nucleicos. As amostras foram testadas para vários vírus bovinos por (RT)qPCR: BPyV, RoV-A, BCoV, BRSV, CCHFV, EHDV, BTV e AIV. O BPyV pareceu ser um bom indicador viral bovino em amostras de lixiviados (13/15) mas não em amostras clínicas (2/99) nem em amostras de água residual de matadouros (5/8, com baixas concentrações). No geral, o RoV-A foi detetado em 31,25% dos lixiviados das quintas e em 75% das amostras de águas residuais dos matadouros e o BCoV foi detetado em amostras de lixiviados e de aerossóis e estava presente em 50% das amostras do matadouro de Sabadell, provando a circulação do vírus em gado na Catalunha. Os vírus AIV, CCHFV, BRSV, EHDV e BTV não foram detetados em nenhuma das amostras individuais e coletivas testadas por (RT)qPCR. Um n(RT)PCR para a deteção do EHDV (com alvo principal nos serotipos 6 e 8) foi desenvolvido no laboratório e mostrou ser eficiente para concentrações tão baixas como 250 GC/rx em amostras biológicas. Para além disso, NGS foi realizado nas amostras ambientais coletivas usando uma plataforma Illumina NextSeq 550 acoplada com enriquecimento do alvo para a caracterização do viroma de gado. O NGS permitiu a deteção de 16 genes virais relacionados com infeções bovinas. Outros vírus não bovinos foram também detetados nas amostras coletivas, incluindo vírus não detetados por (RT)qPCR, como BRSV e BPyV em aerossóis. Contudo, o método mostrou algumas dificuldades em capturar genomas de cadeia dupla de RNA, como é o caso do RoV-A, detetado em grandes quantidades por (RT)qPCR. Neste trabalho, o uso de amostras ambientais coletivas revelou-se apropriado para a vigilância de vírus em circulação na indústria de gado, sugerindo o seu potencial uso como uma ferramenta de deteção precoce de surtos virais de interesse veterinário na população de vacas, ou para monitorizar a circulação de vírus potencialmente zoonóticos.
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Bovine viruses Viral surveillance Environmental collective samples (RT)qPCR Virome Vírus bovinos Vigilância viral Amostras ambientais coletivas Viroma
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