ESB - Teses de Doutoramento / Doctoral Theses
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- Association of micro and nanocarriers with thin films for buccal delivery of bioactive moleculesPublication . Castro, Pedro João Neves Miranda de; Pintado, Maria Manuela Estevez; Sarmento, Bruno; Madureira, RaquelVisando o aumento da biodisponibilidade dos compostos bioactivos administrados por via oral (com especial ênfase para a absorção bucal), o plano de trabalhos deste programa doutoral visou a optimização de formulações de filmes orais e de micro- e nanopartículas que, conjugados constituam sistemas inovadores com atividade sinérgica. As moléculas bioactivas seleccionadas para estudar o comportamento e eficácia das formulações optimizadas foram a cafeína e dois péptidos presentes na proteína do soro do leite com actividades antihipertensora (sequência: KGYGGVSLPEW) e relaxante (sequência: YLGYLEQLLR). O processo de optimização das formulações foi iniciado pela seriação e comparação preliminar dos excipientes para a produção de filmes e micro/nanopartículas. No primeiro estudo realizado, foram optimizadas e comparadas duas formulações de filmes (usando-se os polímeros carboximetilcelulose sódica e gelatina tipo A) como veículos para libertação oral de cafeína. Verificou-se, através da análise por espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier com reflectância total atenuada (FTIR-ATR), que a estrutura química da cafeína não fora alterada durante o processo de produção dos filmes. Concluiu-se também, através do ensaio de dissolução estabelecido pela Farmacopeia Americana (USP), que os filmes produzidos com gelatina tipo A permitiram uma libertação mais lenta da cafeína ao passo que os filmes de carboximetilcelulose apresentaram um perfil de libertação imediata. Em concordância, o valor de permeabilidade aparente da cafeína, determinada através do ensaio de permeabilidade ex vivo, através de excisões de intestino delgado de origem porcina, verificou-se superior quando esta foi veiculada pelos filmes de carboximetilcelulose, comparativamente com os filmes de gelatina tipo A. O tempo de desintegração de ambas as formulações mostrou-se, contudo, demasiado alto para formulações orodispersíveis, não ocorrendo desintegração completa após 30 segundos. Ainda na sequência da escolha do polímero com melhores características para integrar a composição de filmes orais, uma nova formulação contendo goma-guar foi optimizada por desenho factorial. Os filmes de goma-guar apresentaram características mecânicas e físico-químicas superiores às verificadas para os filmes de carboximetilcelulose e gelatina, tomando-se como factores de decisão a capacidade de absorção de água, a erosão em saliva artificial e o tempo de desintegração apresentados pelos filmes de goma-guar. Procedeu-se também à optimização (por desenho fatorial) de uma formulação de micropartículas de alginato que garantissem, em conjunto com os filmes de goma-guar, uma libertação controlada de cafeína, assim como uma maior biodisponibilidade da mesma. A associação de micropartículas de alginato aos filmes de gomaguar – GfB - não induziu alterações das características químicas da cafeína, de acordo com o verificado por FTIR-ATR, nem toxicidade para as linhas celulares usadas para mimetizar as mucosas bucal (TR146) e intestinal (Caco-2/HT29-MTX), de acordo com os resultados obtidos pelo ensaio de viabilidade celular MTT (Brometo de 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- Diphenyltetrazólio). Adicionalmente, os perfis de libertação e permeabilidade in vitro (através das linhas celulares TR146 e Caco-2/HT29-MTX cultivadas em camada) e ex vivo (através de epitélio intestinal de origem porcina) mostraram-se mais lentos que os observados para as micropartículas de alginato, filmes de goma-guar ou com a solução controlo de cafeína. A formulação GfB promoveu o aumento do contacto efectivo entre a cafeína e o epitélio bucal, oferecendo uma permeação mais completa ao longo do tempo. De forma a incrementar também a biodisponibilidade do péptido KGYGGVSLPEW com actividade anti-hipertensora, as micropartículas de alginato foram substituídas por nanopartículas de ácido poli(láctico-co-glicólico) – PLGA - por estas oferecerem uma eficácia de associação superior, assim como um maior potencial de permeação das membranas biológicas, dado o tamanho de partícula ser significativamente inferior. A formulação de nanopartículas de PLGA foi optimizada por desenho factorial. O sistema compreendido pelas nanopartículas de PLGA associadas aos filmes de goma-guar (GfNp) não comprometeu a viabilidade das linhas celulares TR146 e Caco-2/HT29-MTX às concentrações testadas. O sistema desenvolvido promoveu a libertação e permeabilidade controladas do péptido, através das células TR146 e Caco-2/HT29- MTX cultivadas em camada, comparativamente com os filmes e nanopartículas isoladamente, assim como com a solução de péptido livre (controlo). Contudo, a permeabilidade aparente verificou-se superior para a formulação GfNp, comparativamente com as restantes formulações. Estes resultados deveram-se ao contacto íntimo entre o péptido e o epitélio absorptivo, promovido pela formulação GfNp. Verificou-se ainda, através da realização do ensaio in vitro da capacidade de inibição da enzima conversora da angiotensina I, que o péptido transportado por GfNp apresentava a maior actividade anti-hipertensora após ser sujeito à simulação do tracto gastrointestinal, comparativamente com o péptido transportado pelas nanopartículas ou filme, isoladamente, ou com a solução de péptido livre. O sistema previamente optimizado para a libertação do péptido antihipertensor foi também usado de forma a incrementar a biodisponibilidade do péptido relaxante alfa-casozepina (sequência: YLGYLEQLLR). Através do ensaio MTT, foi possível concluir que nenhuma das formulações comprometeu a viabilidade da linha celular TR146 e da co-cultura Caco-2 /HT29- MTX. Por isso, a permeabilidade do péptido, sujeito às condições do tracto gastrointestinal simulado, através dos modelos in vitro bucal e intestinal foi estudada. Verificou-se que a associação de nanopartículas de PLGA com filmes de goma-guar promoveu um aumento da permeabilidade face às nanopartículas e filmes não conjugados, assim como com o péptido em solução (controlo). Estes resultados estão correlacionados com o incremento da mucoadesão conferida pela associação das nanopartículas de PLGA com os filmes de goma-guar, verificada através da análise da adesividade e trabalho de adesão à língua de vaca. Validada a efectividade das formulações para a libertação e permeabilidade de cafeína e péptidos bioactivos, foram realizados estudos preliminares de modo a verificar a estabilidade da formulação GfB e a compreender a opinião de potenciais futuros consumidores face aos produtos desenvolvidos. As formulações foram sujeitas a condições de degradação acelerada (i.e. 40 ºC e 75% de humidade relativa) de acordo com a International Conference of Harmonization (ICH), não se verificando alterações químicas da cafeína em nenhum dos tempos de amostragem (imediatamente após a preparação da formulação e após 3, 6 e 9 meses) através da análise do espectro obtido por ATR-FTIR, assim como dos tempos de retenção em HPLC-UV. Verificou-se ainda um aumento significativo do conteúdo em água de GfB ao longo dos tempos de amostragem. Por fim, um estudo por focus group e um estudo de análise sensorial com um painel naive permitiram compreender a adequabilidade dos sabores propostos, assim como a tolerância à acidez e amargor por parte do consumidor. Observou-se uma ligeira tendência para a aceitação do sabor a menta e alguma tolerância ao amargor e acidez quando a menta foi usada na formulação. Os sistemas para libertação oral de compostos bioactivos, desenvolvidos e optimizados no âmbito desta tese, induziram melhorias significativas no comportamento farmacocinético in vitro dos compostos veiculados. De facto, a associação de filmes orais com micro- ou nanopartículas pode representar um novo sistema de libertação que ofereça maior efectividade e adesão por parte do consumidor/utente.
- Biotechnology of microalgae : study of the influence of biochemical and culture parameters on the production of biomass and bioactive compoundsPublication . Raposo, Maria Filomena de Jesus; Morais, Rui Manuel Santos Costa de; Bernardo, Alcina Maria MirandaA biotecnologia das microalgas está a ganhar cada vez mais importância, havendo já um número significativo de estudos publicados. Contudo, a grande maioria dos trabalhos realizados continua a ser com macroalgas. A maior parte dos estudos com macro- e microalgas têm, contudo, uma base empírica, relacionada com os organismos congéneres que são as plantas vasculares. No trabalho apresentado nesta Tese revemos inicialmente algumas das aplicações das microalgas, em especial as de origem marinha. Após uma resenha sobre os polissacarídeos (capítulo 1.1), focamo-nos na aplicação (potencial) dos biocompostos na saúde humana, em geral (capítulo 1.2) e nas doenças cardiovasculares, em particular (capítulo 1.3) e ainda em doenças crónicas como as relacionadas com o stress oxidativo, a diabetes ou o Parkinson, devido às suas propriedades antioxidantes. Em seguida, aprofundamos o conhecimento sobre os polissacáridos algais (capítulo 2). Neste capítulo, revemos as características bioquímicas deste tipo de polímeros e mostramos algumas das vastas aplicações dos polissacáridos produzidos pelas microalgas (capítulo 2.1). Mostramos ainda quão abrangente pode ser a utilização destes compostos, quer em aplicações médicas (capítulo 2.2), quer em nutrição, devido à sua riqueza em fibras (capítulo 2.3). Sabendo que duas das espécies produtoras de elevadas quantidades de carotenoides são a Dunaliella salina e a Haematococcus pluvialis, desenvolvemos um primeiro trabalho experimental em que os respectivos meios de cultura foram enriquecidos com as fito-hormonas cinetina (kin) e ácido diclorofenoxiacético (2,4-D) (capítulo 3.1). A influência positiva de 2,4-D foi bastante significativa, dado que a adição de 1.0 mg /l meio de cultura de H. pluvialis, sózinha ou em conjunto com kin (1.0 mg /l), aumentou a produção de biomassa em 320% e 290% respectivamente. Uma ainda menor concentração de 2,4-D (0.5 mg /l) induziu, em D. salina (a 15% salinidade, NaCl m/v), um aumento de 410% no número de células. Num trabalho experimental posterior submeteu-se a Haematococcus a condições de stress (privação de nutrientes e luminosidade elevada) para indução da carotenogénese. A biomassa foi depois recolhida e procurou-se a melhor forma de manter a estabilidade dos carotenoides produzidos e uma taxa de degradação mais reduzida. As melhores condições de preservação verificaram-se quando se secou as algas por atomização (temperatura de entrada de 180ºC e temperatura de saída de 110ºC) e armazenamento dos pós a -21ºC em azoto. Desta forma conseguiu-se recuperar 90% do pigmento astaxantina (capítulo 4). Quando se manipulou o meio de cultura de Porphyridium cruentum, verificou-se que a adição de sulfato (21 mM em sulfato) aumentou a produção do exopolissacárido (EPS), e o conteúdo em proteína (52 mM e 104 mM em sulfato) e sulfato (104 mM) no EPS. Contudo, as características físico-químicas do polímero não sofreram alterações. Este EPS mostrou possuir capacidade antiviral, em especial contra o vírus Vesicular estomatitis (capítulo 3.2). Duas experiências diferentes permitiram mostrar que as microalgas têm também aplicação na área ambiental (capítulo 5). Verificou-se que a flora autóctone de um efluente de cervejeira pode ser utilizada para remoção de grande parte do azoto e fósforo, mas também para remover uma parte significativa da carga orgânica dessa água residual. Devido à qualidade da proteína obtida — na qual se observou um aumento de vários aminoácidos essenciais — e do perfil lipídico da biomassa — tendo-se verificado um aumento de alguns ácidos gordos como o ácido eicosapentaenóico (ou EPA) —, a biomassa final pode ser recolhida e eventualmente utilizada em rações para animais, ou ainda para produção de biodiesel (capítulo 5.1). Numa última experiência testou-se a influência da utilização das microalgas, tanto sozinhas como em consórcio com rizobactérias promotoras do crescimento, no melhoramento dos solos. Os pós das algas Chlorella vulgaris e/ou dos consórcios obtidos por atomização foram também incluídos em microcápsulas revestidas por maltodextrina (MD) e goma-arábica (GA) ou gelatina (G). Os consórcios de Chlorella:Stenotrophomonas encapsulados em MD:G e MD:GA 1:1 (m/m) foram os que induziram um melhor crescimento, em termos de biomassa seca, tanto da raiz, como da parte aérea das plantas utilizadas neste estudo (capítulo 5.2). Resumindo, pensamos que, com estes trabalhos, contribuímos para o aumento do conhecimento em biotecnologia de microalgas e teremos talvez alertado para o grande potencial das microalgas, especialmente as de origem marinha, devido à sua grande variedade e riqueza da sua biomassa em compostos bioactivos.
- Development and characterization of bioactive edible films and coatings by incorporation of functional bacteriaPublication . Pereira, Joana Odila Mendes Sá; Pintado, Maria Manuela Estevez; Gomes, Ana Maria PereiraA inovação no mercado alimentar tem sido associada à procura de alimentos seguros e nutritivos que previnam ou controlem doenças, promovendo a saúde e a qualidade de vida. Portanto, é imperativo que as empresas alimentares criem novos produtos baseados em ingredientes e formulações inovadoras. Revestimentos e filmes comestíveis elaborados a partir de proteínas do soro surgem como uma alternativa às embalagens convencionais, sendo uma valorização sustentável de subprodutos da indústria alimentar. Neste sentido, o principal objetivo deste programa de doutoramento foi o desenvolvimento e caracterização de revestimentos e filmes bioativos comestíveis, feitos a partir de proteína de isolada de soro (PIS) ou alginato (ALG), incorporados com bactérias probióticas e prebióticos para melhorar o valor funcional, qualidade e segurança dos alimentos. Assim, na primeira secção, foi realizada a incorporação e avaliada a estabilidade de Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 e Lactobacillus casei 01 em filmes comestíveis de PIS. Os filmes foram avaliados ao longo de 60 dias a 23 e 4 °C, e os resultados mostraram que as células viáveis permaneceram elevadas, atingindo 106 unidades formadoras de colonias (UFC)/g. A B. animalis subsp. lactis BB-12 permitiu maiores contagens viáveis durante o período de armazenamento. Além disso, as propriedades físicas cor, atividade da água, espessura, textura e estrutura molecular foram avaliadas e permaneceram estáveis durante todo o período de armazenamento em ambas as temperaturas. Para corroborar esta afirmação, os filmes foram usados para revestir fatias de fiambre, para entender se estes eram capazes de manter a viabilidade probiótica e conferir eficiência antimicrobiana, promover a preservação de fiambre e, eventualmente, aumentar o seu prazo de validade. Estes revestimentos comestíveis inibiram o crescimento detetável de Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Enterobacteriaceae e leveduras/bolores durante 45 dias de armazenamento, a 4 °C. As fatias de fiambre revestidas perderam menos água e não mostraram alteração de cor em comparação com fatias não revestidas. Uma avaliação sensorial revelou uma preferência pelo fiambre revestido em comparação com o fiambre tradicional. No final do Resumo VIII armazenamento, o número de células viáveis foi mantido a 108 UFC/g sugerindo que o fiambre fatiado é um transportador adequado para as estirpes probióticas até após 45 dias de armazenamento. Na segunda secção, foi avaliada a viabilidade de B. animalis subsp. lactis BB-12 em filmes de PIS e ALG incorporando prebióticos (inulina e fructooligosacarídeos (FOS)), a 23 ºC durante 60 dias. A incorporação do prebiótico melhorou a sobrevivência de B. animalis subsp. lactis BB-12, mantendo-o a ca. 106 UFC/g até ao final do armazenamento, com a inulina a apresentar os melhores resultados. A análise estrutural não demonstrou diferenças entre os filmes sem e com prebióticos e probióticos. Além disso, o teor de humidade e a solubilidade em água diminuíram com a incorporação de prebióticos. Como prova de conceito, uma barra de cereais foi desenvolvida com os revestimentos comestíveis com B. animalis subsp. lactis BB-12 e inulina, e a aceitabilidade do consumidor, as propriedades físico-químicas e microbiológicas foram avaliadas durante 90 dias de armazenamento. A PIS foi a melhor solução de revestimento mantendo a viabilidade celular em barras de cereais durante o armazenamento e após a digestão in vitro. Durante todo o período de armazenamento, as propriedades físico-químicas de todos os tipos de barras não mudaram. No entanto, as barras revestidas apresentaram valores mais altos de atividade da água e teor de humidade comparativamente às barras não revestidas. Cor e textura não foram afetadas após o revestimento das barras. Os parâmetros sensoriais mostraram que as barras revestidas foram tão bem aceites como as barras controlo. Além disso, os consumidores apreciaram mais o odor e o sabor das barras revestidas com PIS do que as barras revestidas com ALG. No geral, com base neste projeto, conseguimos obter revestimentos comestíveis e filmes à base de proteínas de soro com probióticos, que também podem conter prebióticos na sua composição, para garantir a estabilidade dos probióticos, a segurança dos alimentos e o aumento do nível nutricional e funcional dos mesmos. Além disso, a indústria de embalagens pode rever estratégias para vender embalagens comestíveis e biodegradáveis, assim como a indústria alimentar pode aumentar a vida útil dos seus alimentos, mantendo-os seguros e tornando-os funcionais.
- Development and characterization of functional ingredients through valorization of spent brewer yeast : peptide concentrates and ß-glucans with biological activitiesPublication . Amorim, Maria Manuela Faria; Pintado, Maria Manuela Estevez; Pinheiro, HélderA crescente preocupação da sociedade com o bem-estar e a utilização de práticas verdes e sustentáveis tem levado à promoção de ações que visam explorar recursos de alto valor, e que podem ser convertidos em compostos de interesse biológico. Entre essas ações, encontra-se o aproveitamento da levedura de cerveja, representando o segundo maior subproduto da indústria cervejeira, e que possui elevado valor nutricional e biológico. Por este motivo, existe um grande interesse em encontrar aplicações sustentáveis para a valorização deste subproduto. Uma estratégia de valorização integrada que pode passar por métodos de autólise, hidrólise e fracionamento, pode ser uma metodologia eficiente para à recuperação de compostos diferenciados e de interesse biológico. Assim, o principal objetivo desta tese de doutoramento foi utilizar o subproduto de levedura de cerveja no desenvolvimento de ingredientes funcionais: concentrados peptídicos e glucanas; caracterizar e validar atividades biológicas em doenças crónicas que afetam grande parte da população atual, tais como, doenças cardiovasculares, obesidade e distúrbios imuno-inflamatórios. Inicialmente, foi avaliado o efeito da autólise e a subsequente hidrólise da levedura com um extrato enzimático vegetal de Cynara cardunculus, com o objetivo de definir as condições ótimas para maximizar a atividade inibitória da enzima conversora da angiotensina (I-ECA), indicado por valores de concentração necessária para inibir 50% da ECA (IC50). De acordo com os modelos de resposta, as condições que permitiram obter autólise máxima foram à temperatura de 70 ºC com um tempo de reação de 5 h, seguida de uma hidrólise com uma relação de enzima/substrato de 4% (v/v) durante 4.5 h com valor de IC50 de 146.1 ± 8.3 μg mL-1 de I - ECA. Finalmente, a realização de uma nanofiltração com membrana de 3 kDa permitiu a separação de péptidos de baixo peso molecular que exibiram uma maior atividade I- ECA (IC50 84.2 ± 11 μg mL-1), permanecendo estável ao longo do trato gastrointestinal simulado em condições in vitro. As condições de autólise e hidrólise, previamente otimizadas, foram selecionadas para aplicação em processos de ultrafiltração e nanofiltração à escala piloto para fracionamento de diferentes compostos. Foram obtidas quatro frações de diferentes pesos moleculares, e foram avaliadas quanto às suas atividades biológicas in vitro: I-ECA (com intervalos de IC50 84 - 260 μg mL-1) e atividade antioxidante (7 - 4 μM TE mg-1). A fração proteica retida (PRH >3 kDa e PRH <3 kDa) mostrou os melhores valores in vitro, sendo desta forma usada posteriormente nos testes in vivo. Foi determinado o efeito anti-hipertensivo oral num modelo in vivo de ratos espontaneamente hipertensos (SHR), e demonstrou-se que a fração de baixo peso molecular (PRH <3 kDa) causou uma diminuição mais percetível na pressão arterial sistólica, diastólica e média dos SHR. Desta forma, esta fração foi estudada (PRH <3 kDa) em um modelo animal de obesidade induzida por uma dieta hiperlipídica (HF), e observou-se que a ingestão diminuiu a ingestão de alimentos e de energia dos animais na dieta HF. Os níveis de peso corporal e leptina diminuíram a partir da décima semana de tratamento. Em relação à microbiota intestinal, não foi observado impacto negativo na microbiota dos animais. Assim, essas propriedades destacam o uso como ingrediente nutracêutico ou funcional para o tratamento da obesidade. Por outro lado, as frações obtidas foram avaliadas quanto a sua capacidade de proteção na mucosa gástrica em um modelo animal com lesões ulcerativas causadas pela administração oral de etanol absoluto. Verificou-se que a fração de baixo peso molecular (PRH <3 kDa), reduziu as lesões gástricas a níveis significativos e o efeito citoprotetor poderá estar relacionado com mecanismos mediados por prostaglandinas e não específicos. Foram testadas as atividades antiproliferativas das frações em nove linhas celulares tumorais humanas e os resultados exibiram uma promissora atividade antiproliferativa contra a linha celular K-562 (leucemia). No que diz respeito aos componentes da parede celular de levedura contidos na fração de alto peso molecular (PRH >3 kDa), estes foram separados, caracterizados quimicamente e o efeito pré-biótico e imunoestimulante foi avaliado. O extrato obtido é composto por um complexo polisacarídico semelhante ao glicogênio, com prevalência de ligações 1,4-glucanas e mostrou um estímulo do crescimento das de estirpes probióticas (lactobacilos e bifidobactérias) selecionadas. Os resultados mostraram a capacidade de assimilação destes substratos atuando como fontes de carbono e em consequência, a elevada produção de ácidos orgânicos e ácidos gordos de cadeia curta. Em relação aos ensaios imunológicos, foi observado uma ativação significativa de células B em baixas concentrações de polissacarídeo (10 μg mL-1). Finalmente, como prova de conceito, foi testada a inclusão da fração (PRH >3 kDa) numa matriz alimentar de forma a avaliar o impacto no sabor e que pode influenciar a escolha do consumidor. Assim, foi formulada uma barra de cereal à base de uma mistura de aveia, arroz e banana desidratada com 2% de extrato de levedura. Os testes de aceitação do consumidor mostraram uma resposta positiva para todos os atributos avaliados. Assim, as barras de cereais mostraram ser uma matriz alimentar adequada para incorporar ingredientes bioativos de levedura. Os resultados deste trabalho experimental contribuirão para a sustentabilidade da indústria cervejeira, no conceito de economia circular, através do desenvolvimento de compostos de valor acrescentado, num modelo de biorefinaria, com impacto biológico em doenças crônicas.
- Exploring new sustainable solutions based on chitosan and cellulose crystals towards the preventive conservation of cultural heritagePublication . Silva, Nádia Suati Caetano da; Costa, Patrícia Raquel Fernandes de Melo Moreira da; Pintado, Maria Manuela Estevez; Madureira, Ana Raquel Mendes Ferreira MonteiroOutdoor sculptures made of stone and mortar are a significant part of the worldʼs cultural heritage. Consequently, their conservation is of great importance, mainly due to their vulnerability to deterioration. Deterioration occurs as a combination of factors that cause alterations and devalue the artworks over time, including those resulting from biodeterioration mechanisms triggered by the growth and activity of microorganisms. Developing sustainable strategies to slow down the proliferation of microorganisms is necessary to reduce the negative environmental and human health impacts of currently used toxic biocides. Hence, this thesis aims to contribute to developing low-toxicity and more sustainable antimicrobial coatings for the preventive conservation of stone heritage, particularly outdoor sculptures. Firstly, an evaluation of the biocontamination and microbiological composition of five outdoor sculptures, made of different materials and located in the district of Porto (Portugal), was performed. Two methodologies were tested to collect samples from the sculptures in a non-invasive and non-destructive way: cotton swabs (classical approach) and poly(2-hydroxyethyl methacrylate) cryogels (alternative method). The quantification and determination of the cell viability of the microorganisms collected were performed by flow cytometry, which proved to be an analytical technique of interest for microbiological studies of cultural heritage. Both methods were effective, although higher concentrations of microorganisms were collected with swabs, while data visualisation of viable and non-viable cells was clearer with cryogels. Consequently, swab samples were taken to characterise the epilithic bacterial and fungal communities of the sculptures. High-throughput sequencing revealed great taxonomic diversity and species richness, including in well-preserved sculptures. Fungal diversity was lower than that of the bacterial communities. Proteobacteria was the core taxa common to all the sculptures. Ascomycota were also detected in all the sculptures and Basidiomycota were a significant part of the microbiomes in granite, where an abundance of pigment-producing microorganisms was also found. Additionally, colourimetry and adenosine triphosphate quantification assays quickly identified contaminated areas of the sculptures. The next stage of the work dealt with the preparation and characterisation of chitosan formulations, to be used as antimicrobial coatings to inhibit the growth of microorganisms in sculptures. The first set of formulations consisted of chitosan solutions containing citric acid and different concentrations of sodium tripolyphosphate (CHGCA-TPP), which were polymerised into films for their characterisation. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy confirmed the establishment of cross-linking interactions, and the films exhibited partial wettability (40.81-31.44°), solubility (43.64-55.14%) and swelling (123.36-75.17%) in water, but allowed water vapour exchanges due to their high permeability (140.055-372.575 g m-2 d). The films reduced the growth of microorganisms that commonly colonise stone heritage: Staphylococcus aureus (0.87-1.58-log reduction), Bacillus cereus (ca. 1-3-log reduction), Rhodotorula spp. (between 0.73-1.27-log reduction and complete inhibition) and Penicillium chrysogenum (11.92-21.48% inhibition). Another set of formulations was prepared to enhance the properties of the CHGCA-TPP formulations. A screening was conducted with chitosan solutions containing microcrystalline cellulose (MCC) or cellulose nanocrystals, and the chosen formulation was supplemented with oregano essential oil (OEO) at 1% and 2%. Cross-linking interactions and incorporation of OEO were confirmed by FTIR analysis of the films, which remained poorly soluble (15.74-16.85%), with low percentages of swelling (16.10-28.22%) and relatively low wettability (> 70°). These formulations are an improvement on the CHGCA-TPP ones, including their antimicrobial action, since the films containing 2% OEO completely inhibited the growth of S. aureus, Rhodotorula spp. and P. aeruginosa, induced ca. 60% inhibition of P. chrysogenum and reduced the growth of B. cereus. Lastly, the two most promising formulations (CHGCA-TPP-a and 2-MCC-OEO-2) were tested in granite, limestone and marble samples. Both formulations polymerised on the stones’ surfaces, as confirmed by scanning electron microscopy and FTIR spectroscopy, but formed irregular coatings. The CHGCA-TPP-a coating reduced the wettability of granite and limestone, while 2-MCC-OEO-2 did the same in a more pronounced way and in all stone types. Neither coating caused visible colour changes when the formulations were applied with a brush. In vitro antimicrobial assays with stone samples inoculated with selected strains showed that CHGCA-TPP-a inhibited the growth of B. cereus, Rhodotorula spp. and P. aeruginosa in granite after 7 days to ca. 4 to 5 log10 (CFU mL -1 ). In contrast, 2-MCC-OEO-2 reduced the concentrations of viable cells in all stone types to ca. 3 to 5 log10 (CFU mL -1 ) depending on the strain. In situ antimicrobial assays, where samples were placed in an outdoor setting, showed that CHGCA-TPP-a did not have an inhibitory effect under the conditions tested, with concentrations of viable cells equal to or higher than those of uncoated slabs, regardless of the mode of application of the formulation (deposition with a micropipette or spreading by brush) or the number of treatments over the assay period. However, multiple applications of 2-MCC-OEO-2 with a micropipette over time reduced the concentrations of viable cells in granite and marble, but the same occurred only in limestone when the coating was applied with a brush. In conclusion, this work added to the knowledge of the biocontamination and diversity of the microbiomes of outdoor sculptures, in particular of the Porto district in Portugal, which can help outline future conservation strategies. The chitosan formulations tested, especially those with MCC and OEO, are a potential base for further development and optimisation of novel low-toxicity antimicrobial coatings towards more sustainable preventive conservation strategies of stone heritage.
- Growth and metabolic response of forest trees to inoculation with microbial symbiontsPublication . Araújo, Giovânia Carvalho; Castro, Paula Maria Lima; Sousa, Nadine Reis deO objetivo geral desta tese foi aprofundar o conhecimento da relação entre espécies arbóreas e simbiontes promotores de crescimento de plantas. Questões levantadas em outros trabalhos relativas à variação dos efeitos do simbionte na planta hospedeira, constituiram o mote para o trabalho realizado. A compreensão dos fatores que afetam a simbiose é importante para ajudar a ultrapassar possiveis limitações de um processo de inoculação após o transplante das árvores. Os simbiontes de interesse neste estudo são fungos ectomicorrízicos-ECM e bactérias que potencialmente atuam como bacterias auxiliadoras de micorrizaçao-MHB. A resposta da planta hospedeira, compreendendo características biométricas e perfil metabólico, à inoculação foi avaliada sob diferentes perspectivas: composição do inóculo, compreendendo fungos ECM e bactérias (espécies e isolados diferentes), e condições de crescimento da planta hospedeira em diferentes estágios, em microcosmo e em viveiro. A primeira tarefa consistiu no estudo do desempenho de um inóculo duplo (Suillus granulatus (L.) Roussel + Mesorhizobiumm sp.) em Quercus suber cultivado em viveiros localizados em diferentes ambientes, em comparação com um inóculo comercial. Com base nos resultados biométricos e nutricionais, observou-se que a resposta da planta diferiu entre os dois viveiros. A comunidade ECM estabelecida também variou entre os diferentes tratamentos. Entre os inóculos, o inóculo duplo foi mais consistente em melhorar o desempenho de Q. suber. Posteriormente, foi avaliado o efeito de dois isolados distintos de S. granulatus em plântulas de Pinus pinea crescidas em condições axênicas em substrato e após o transplante para solo natural. A partir das análises biométricas e nutricionais, observou-se que os dois isolados promoveram o crescimento das plantas no substrato, diferindo das plântulas não inoculadas. Nesse substrato estéril as plântulas de P. pinea apresentaram diferenças no perfil de compostos fenólicos devido à presença dos fungos. Nas condições naturais do solo, os dois isolados causaram uma resposta diferente na planta para a maioria dos parâmetros analisados, com um dos isolados superando o outro em relação ao crescimento das plântulas. Embora S. granulatus tenha persistido nas raízes de Q. suber, a análise de sequenciamento genético não confirmou a sua presença após os 180 dias em raízes de P. pinea no solo natural, indicando que provavelmente aquele foi substituído por fungos nativos. No entanto, a inoculação influenciou a estrutura da comunidade fúngica estabelecida e foi importante para o estabelecimento de plântulas no período inicial após o transplante, conforme verificado pelabiomassa superior das plântulas inoculadas. Na terceira tarefa, foi usado um outro fungo ECM, Lactarius deliciosus, como inoculo em plântulas de P. pinea, com o objetivo de avaliar seu efeito sobre o hospedeiro crescendo em diferentes substratos. O desempenho das plantas inoculadas foi comparado em duas fases: (i) em microcosmo com turfa estéril + vermiculita como substrato e posteriormente (ii) em dois solos naturais. A relação simbiótica foi dependente das condições de crescimento das plantas hospedeiras. Registou-se uma maior diferença no desenvolvimento de plântulas na fase de crescimento em solo natural, com biomassa de parte aérea com diferença de até 2.35 vezes entre os solos. Além disso, os perfis dos compostos fenólicos em P. pinea também diferiram consideravelmente entre os dois solos. Na quarta tarefa, avaliou-se a resposta da mesma planta hospedeira à inoculação com o fungo Pisolithus tinctorius e a bactéria Bacillus subtilis, numa tentativa de elucidação da interação entre os parceiros microbianos. Este estudo teve três etapas: (i) avaliação in vitro da interação fungo / bactéria; (ii) microcosmos; (iii) transplante para solo natural. No microcosmo, a concentração dos compostos fenólicos foi avaliada em quatro períodos, 10, 20, 40 e 70 dias. Embora as bactérias tenham inibido o crescimento do fungo in vitro, a mesma in vivo apresentou características de MHB, influenciando positivamente a relação fungo-planta, evidenciada pela biomassa superior de plântulas quando inoculadas com o inóculo duplo, tanto no microcosmo como no solo. Além disso, B. subtilis causou uma maior variação no perfil de compostos fenólicos de P. pinea, especialmente em sinergia com o fungo ECM. Concluiu-se que os simbiontes causaram alterações no perfil metabólico da planta, o que parece estar relacionado com o aumento da plasticidade da planta representada pelo melhor crescimento das plântulas inoculadas em relação ao controle. Com base em todos esses resultados, conclui-se que o efeito da simbiose ECM é dependente das condições de crescimento das plântulas (viveiros), do substrato, das condições do solo e é afetado pela presença de bactérias MHB. Além disso, a análise de compostos fenólicos pode ser usada como uma ferramenta para avaliar a resposta da planta hospedeira ao simbionte.
- Okara (by-produt of soya beverage) : potential application in food and aquafeedPublication . Voss, Glenise Bierhalz; Pintado, Maria Manuela Estevez; Valente, Luísa Maria PinheiroA soja é uma das oleaginosas mais consumidas no mundo. Entre os principais subprodutos da transformação industrial da soja destaca-se o okara. Este subproduto, resultante da produção de bebidas de soja, representa ainda um problema ambiental devido às altas quantidades produzidas. Adicionalmente, o seu elevado teor de humidade (~ 80%) dificulta sua conservação e, consequentemente, a sua posterior utilização. No entanto, apesar da sua perecibilidade, o okara possui uma composição nutricional rica em proteínas, lípidos e fibras bem como elevados teores de compostos com potencial bioativo como as isoflavonas. Neste contexto, o principal objetivo deste programa de doutoramento foi encontrar alternativas para aumentar a estabilidade do okara, através de processos térmicos ou biotecnológicos (nomeadamente hidrólise enzimática e fermentação com bactérias probióticas), por forma a melhorar as propriedades biológicas do okara tendo em vista a sua utilização na alimentação humana bem como na animal, mais especificamente na aquacultura. A primeira parte do trabalho incidiu no estudo do impacto de diferentes temperaturas na secagem do okara (80 ºC/5 h e 200 ºC/1 h). De um ponto de vista microbiológico, em ambas as amostras foi verificada uma redução na contaminação microbiana no tempo inicial. Adicionalmente, no okara seco a 200 ºC foi observada uma redução da atividade dos inibidores de tripsina, no entanto, esta amostra também apresentou uma maior oxidação lipídica durante o armazenamento. De seguida, estudou-se a influência de um processo de autoclavagem (1 atm, 121 ºC por 15 min) prévio à secagem a 65 ºC (AOK) em comparação com o okara seco não autoclavado (NAOK), tendo-se observado que o processo de autoclavagem, além de reduzir a atividade dos inibidores de tripsina (0.86 mg TUI/ mg de amostra seca), manteve as características da farinha de okara durante o armazenamento. Na segunda parte do trabalho foram estudadas diferentes condições (tempo e concentração de enzima) na hidrólise enzimática das farinhas de okara (NAOK e AOK) utilizando duas enzimas, Alcalase (AL) e protéases de Cynara cardunculus (CY). Os resultados mostraram que o processo térmico facilitou o ataque enzimático resultando numa elevada atividade anti-hipertensiva para ambos os hidrolisados (9.97 e 54.30 μg de proteína/mL, AL e CY, respetivamente) bem como antioxidante, em particular para a AL. Este estudo também permitiu a identificação de novas sequências peptídicas para ambas as enzimas. Com base nos resultados anteriores, nomeadamente a atividade anti-hipertensiva, iniciou-se a terceira componente deste iv trabalho, i.e. o desenvolvimento de bebidas fermentadas utilizando okara fresco previamente hidrolisado com CY. Para elaborar as bases da bebida, aos hidrolisados de okara foi adicionada frutose (6% m/v) e frutoligossacarídeos (FOS) (2% m/v), sendo a mistura resultante fermentada utilizando duas bactérias probióticas Bifidobacterium animalis Bb-12 e Lactobacillus rhamnosus R11, individualmente e em mistura. As bebidas fermentadas de okara foram analisadas ao longo de 28 dias de armazenamento com os níveis de células viáveis mantendo-se estáveis durante esse período. Adicionalmente, quando as bebidas de okara foram submetidas ao sistema gastrointestinal (in vitro), verificou-se um aumento das atividades antioxidante e anti-hipertensivas (IC50), o que se poderá traduzir numa maior bioacessibilidade. No entanto, sensorialmente as bebidas fermentadas não foram bem aceites pelos participantes, que indicaram uma acidez elevada e doçura insuficiente. A última parte deste trabalho consistiu na incorporação das farinhas, previamente descritas, em dietas para uma espécie de peixe herbívora, a Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). Começou por se avaliar in vivo a digestibilidade de seis farinhas: NAOK, AOK, okara hidrolisado com AL e autoclavado (ALOK), okara hidrolisado com CY e autoclavado (CYOK), CYOK fermentado com L. rhamnosus R11 (CYR11OK) e CYOK fermentado com B. animalis Bb-12 (CYB12OK). Seguidamente, as farinhas de okara que apresentaram digestibilidades mais elevadas (AOK e CYOK) foram incorporadas em dietas para Tilápia do Nilo (a 10 e 20%) à custa de ingredientes vegetais (farinhas de soja, milho e trigo) de forma a avaliar o seu impacto no crescimento e utilização de nutrientes ao longo de um ensaio de crescimento de 10 semanas. De um modo geral, os resultados mostraram que a incorporação das farinhas de okara selecionadas (até 20%) não alteram significativamente a performance de crescimento nem a utilização de nutrientes da Tilápia do Nilo. Considerando todos os resultados obtidos, é possível concluir que, com um tratamento térmico adequado é possível melhorar a qualidade nutricional do okara e mantê-lo estável durante o armazenamento. Adicionalmente, a hidrólise enzimática e a fermentação podem contribuir para melhorar as características nutricionais e funcionais da okara, quando se consideram aplicações na nutrição humana. Relativamente ao uso de okara na aquacultura, este pode ser incorporado até 20% em dietas para a Tilápia do Nilo, substituindo outros ingredientes de origem vegetal e diminuindo os custos de produção, sem que se verifique qualquer efeito adverso no crescimento dos peixes nem na sua composição corporal.
- Postharvest changes of functional phytochemicals in blueberryPublication . Costa, Daniela de Vasconcelos Teixeira Aguiar da; Pintado, Maria Manuela EstevezOs frutos têm sido descritos como essenciais para uma dieta saudável, devido à sua elevada atividade antioxidante, muito correlacionada com os compostos fenólicos totais e com antocianinas. O mirtilo é um dos frutos descritos com uma elevada atividade antioxidante, associado à redução de risco de várias doenças, incluindo a doença cardíaca, algumas formas específicas de cancro (desempenhando um papel importante no tratamento preventivo nutricional anticancro) e outras doenças crónicas. No entanto, o mirtilo apresenta um tempo de prateleira muito curto sendo afetado por diferentes fatores pré- e pós-colheita. O objetivo geral deste programa de doutoramento passa pela compreensão do efeito de diferentes fatores na qualidade comercial e funcional em mirtilos ao longo do armazenamento, por forma a maximizar ou manter a atividade antioxidante ao longo do armazenamento sem comprometer os outros parâmetros de qualidade. Inicialmente foi realizada a caracterização da qualidade comercial e funcional, assim como do perfil de antocianinas e ácidos hidroxicinâmicos em três cultivares de mirtilo: ‘Bluecrop’, ‘Goldtraube’ e ‘Ozarkblue’ ao longo do armazenamento a 4 ºC, durante 49 dias em 2010 e 56 dias em 2011 e 2012. Foi observado que as antocianinas totais, os compostos fenólicos totais e a atividade antioxidante variam com a cultivar e ano de colheita, sendo que a ação de diferentes características ambientais leva à maior ou menor produção destes compostos, por exemplo em geral, a presença de temperaturas altas pode inibir a biossíntese de flavonoides. Foi realizado um tratamento pós-colheita dos mirtilos com etileno (1000 μL.L-1) com posterior armazenamento a 4 ºC, durante 56 dias. O efeito deste tratamento nas antocianinas totais, compostos fenólicos e na atividade antioxidante parece ser dependente da cultivar. O tratamento com etileno aumentou o teor de antocianinas e a atividade antioxidante na ‘Bluecrop’ e ‘Goldtraube’, o que faz parecer que possa ser uma boa estratégia para manter estes compostos ao longo do armazenamento, uma vez que estes habitualmente apresentam tendência para diminuírem ao longo do mesmo. Foi realizado um tratamento com 1-MCP (1 μL.L-1) em frutos de mirtilo das cultivares ‘Bluecrop’, ‘Goldtraube’ e ‘Ozarkblue’ e comparado com a ação de etileno (1000 μL.L-1). Após o tratamento, os frutos foram armazenados a 4º C durante 56 dias. No final do armazenamento o 1-MCP aumentou o conteúdo de antocianinas e ácidos hidroxicinâmicos em relação aos outros tratamentos nas cultivares ‘Goldtraube’ e ‘Ozarkblue’. Posteriormente testamos o armazenamento em quatro atmosferas controladas diferentes: ar, 2% O2 + 2% CO2, 2% O2 + 15% CO2, e 21% O2 + 15% CO2 em duas cultivares de mirtilo: ‘Goldtraube’ e ‘Ozarkblue’, durante 29 dias a 4 °C. O efeito das diferentes atmosferas foi dependente da cultivar. Enquanto na ‘Goldtraube’ uma baixa concentração de O2 aumentou o teor em antocianinas, a ‘Ozarkblue’ pareceu beneficiar de uma elevada concentração de CO2. Elevadas concentrações de CO2 parecem também ter maior impacto sobre os compostos fenólicos identificados. Com base nesses trabalhos, dependendo da cultivar, podemos maximizar ou manter a atividade antioxidante, sem comprometer outros parâmetros comerciais de qualidade. O tratamento com etileno para o aumento da atividade antioxidante em algumas cultivares pode ser recomendado, em particular quando os frutos são comercializados em mercados locais ou transportados em pequenas distâncias. Os consumidores irão beneficiar desse aumento dos compostos bioactivos e associada atividade antioxidante. O tratamento com 1-MCP pode ser importante para frutos que são comercializados a longas distâncias, para exportação, pois permite que os frutos mantenham a qualidade funcional durante o armazenamento (maior teor de antocianinas e ácidos hidroxicinâmicos no final do armazenamento).