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Publication
Exploring new sustainable solutions based on chitosan and cellulose crystals towards the preventive conservation of cultural heritage
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Authors
Abstract(s)
Outdoor sculptures made of stone and mortar are a significant part of the worldʼs cultural heritage. Consequently, their conservation is of great importance, mainly due to their vulnerability to deterioration. Deterioration occurs as a combination of factors that cause alterations and devalue the artworks over time, including those resulting from biodeterioration mechanisms triggered by the growth and activity of microorganisms. Developing sustainable strategies to slow down the proliferation of microorganisms is necessary to reduce the negative environmental and human health impacts of currently used toxic biocides. Hence, this thesis aims to contribute to developing low-toxicity and more sustainable antimicrobial coatings for the preventive conservation of stone heritage, particularly outdoor sculptures. Firstly, an evaluation of the biocontamination and microbiological composition of five outdoor sculptures, made of different materials and located in the district of Porto (Portugal), was performed. Two methodologies were tested to collect samples from the sculptures in a non-invasive and non-destructive way: cotton swabs (classical approach) and poly(2-hydroxyethyl methacrylate) cryogels (alternative method). The quantification and determination of the cell viability of the microorganisms collected were performed by flow cytometry, which proved to be an analytical technique of interest for microbiological studies of cultural heritage. Both methods were effective, although higher concentrations of microorganisms were collected with swabs, while data visualisation of viable and non-viable cells was clearer with cryogels. Consequently, swab samples were taken to characterise the epilithic bacterial and fungal communities of the sculptures. High-throughput sequencing revealed great taxonomic diversity and species richness, including in well-preserved sculptures. Fungal diversity was lower than that of the bacterial communities. Proteobacteria was the core taxa common to all the sculptures. Ascomycota were also detected in all the sculptures and Basidiomycota were a significant part of the microbiomes in granite, where an abundance of pigment-producing microorganisms was also found. Additionally, colourimetry and adenosine triphosphate quantification assays quickly identified contaminated areas of the sculptures. The next stage of the work dealt with the preparation and characterisation of chitosan formulations, to be used as antimicrobial coatings to inhibit the growth of microorganisms in sculptures. The first set of formulations consisted of chitosan solutions containing citric acid and different concentrations of sodium tripolyphosphate (CHGCA-TPP), which were polymerised into films for their characterisation. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy confirmed the establishment of cross-linking interactions, and the films exhibited partial wettability (40.81-31.44°), solubility (43.64-55.14%) and swelling (123.36-75.17%) in water, but allowed water vapour exchanges due to their high permeability (140.055-372.575 g m-2 d). The films reduced the growth of microorganisms that commonly colonise stone heritage: Staphylococcus aureus (0.87-1.58-log reduction), Bacillus cereus (ca. 1-3-log reduction), Rhodotorula spp. (between 0.73-1.27-log reduction and complete inhibition) and Penicillium chrysogenum (11.92-21.48% inhibition). Another set of formulations was prepared to enhance the properties of the CHGCA-TPP formulations. A screening was conducted with chitosan solutions containing microcrystalline cellulose (MCC) or cellulose nanocrystals, and the chosen formulation was supplemented with oregano essential oil (OEO) at 1% and 2%. Cross-linking interactions and incorporation of OEO were confirmed by FTIR analysis of the films, which remained poorly soluble (15.74-16.85%), with low percentages of swelling (16.10-28.22%) and relatively low wettability (> 70°). These formulations are an improvement on the CHGCA-TPP ones, including their antimicrobial action, since the films containing 2% OEO completely inhibited the growth of S. aureus, Rhodotorula spp. and P. aeruginosa, induced ca. 60% inhibition of P. chrysogenum and reduced the growth of B. cereus. Lastly, the two most promising formulations (CHGCA-TPP-a and 2-MCC-OEO-2) were tested in granite, limestone and marble samples. Both formulations polymerised on the stones’ surfaces, as confirmed by scanning electron microscopy and FTIR spectroscopy, but formed irregular coatings. The CHGCA-TPP-a coating reduced the wettability of granite and limestone, while 2-MCC-OEO-2 did the same in a more pronounced way and in all stone types. Neither coating caused visible colour changes when the formulations were applied with a brush. In vitro antimicrobial assays with stone samples inoculated with selected strains showed that CHGCA-TPP-a inhibited the growth of B. cereus, Rhodotorula spp. and P. aeruginosa in granite after 7 days to ca. 4 to 5 log10 (CFU mL -1 ). In contrast, 2-MCC-OEO-2 reduced the concentrations of viable cells in all stone types to ca. 3 to 5 log10 (CFU mL -1 ) depending on the strain. In situ antimicrobial assays, where samples were placed in an outdoor setting, showed that CHGCA-TPP-a did not have an inhibitory effect under the conditions tested, with concentrations of viable cells equal to or higher than those of uncoated slabs, regardless of the mode of application of the formulation (deposition with a micropipette or spreading by brush) or the number of treatments over the assay period. However, multiple applications of 2-MCC-OEO-2 with a micropipette over time reduced the concentrations of viable cells in granite and marble, but the same occurred only in limestone when the coating was applied with a brush. In conclusion, this work added to the knowledge of the biocontamination and diversity of the microbiomes of outdoor sculptures, in particular of the Porto district in Portugal, which can help outline future conservation strategies. The chitosan formulations tested, especially those with MCC and OEO, are a potential base for further development and optimisation of novel low-toxicity antimicrobial coatings towards more sustainable preventive conservation strategies of stone heritage.
Esculturas em pedra e cimento de exterior são uma parte significativa do património cultural mundial. Consequentemente, a sua conservação é de grande importância, principalmente devido à sua vulnerabilidade à deterioração. A deterioração resulta de uma combinação de fatores que alteram e desvalorizam as obras de arte ao longo do tempo, incluindo os que resultam de mecanismos de biodeterioração originados pelo crescimento e atividade de microrganismos. É necessário desenvolver estratégias sustentáveis para desacelerar a proliferação de microrganismos e reduzir os impactos negativos no ambiente e saúde humana de biocidas tóxicos atualmente utilizados. Assim, esta tese procura contribuir para o desenvolvimento de revestimentos antimicrobianos, de baixa toxicidade e mais sustentáveis, para a conservação preventiva de património cultural em pedra, particularmente de esculturas de exterior. Primeiramente, foi realizada uma avaliação da biocontaminação e composição microbiológica de cinco esculturas de exterior, compostas por diferentes materiais e localizadas no distrito do Porto (Portugal). Foram testadas duas metodologias para recolha de amostras das esculturas de forma não invasiva e não destrutiva: zaragatoas de algodão (abordagem clássica) e criogéis de poli(2-hidroxietilmetacrilato) (método alternativo). A quantificação e determinação da viabilidade celular dos microrganismos recolhidos foi realizada por citometria de fluxo, que provou ser uma técnica analítica de interesse para estudos microbiológicos de património cultural. Ambos os métodos foram eficazes, apesar de concentrações superiores de microrganismos terem sido obtidas com zaragatoas, enquanto a visualização dos dados de células viáveis e não viáveis foi mais clara com criogéis. Por conseguinte, foram recolhidas amostras com zaragatoas para caracterizar as comunidades epilíticas bacterianas e fúngicas das esculturas. A sequenciação de alto rendimento revelou grande diversidade taxonómica e riqueza de espécies, incluindo em esculturas bem preservadas. A diversidade fúngica foi inferior à das comunidades bacterianas. Proteobacteria foi o principal grupo taxonómico comum a todas as esculturas. Foram também detetados Ascomycota em todas as esculturas e Basidiomycota formaram uma parte significativa dos microbiomas de granito, onde também foi encontrada uma abundância de microrganismos produtores de pigmentos. Adicionalmente, ensaios de colorimetria e de quantificação de adenosina trifosfato rapidamente identificaram áreas contaminadas das esculturas. A fase seguinte do trabalho incidiu sobre a preparação e caracterização de formulações de quitosano, para serem usadas como revestimento antimicrobiano para inibir o crescimento de microrganismos em esculturas. O primeiro conjunto de formulações consistiu em soluções de quitosano com ácido cítrico e diferentes concentrações de tripolifosfato de sódio (CHGCA-TPP), que foram polimerizadas em filmes para a sua caracterização. Espectroscopia de infravermelhos com transformada de Fourier (FTIR) confirmou o estabelecimento de interações de ligação cruzada, e os filmes exibiram molhabilidade (40.81-31.44°), solubilidade (43.64-55.14%) e swelling (123.36-75.17%) parciais em água, mas permitiram trocas de vapor de água devido à sua alta permeabilidade (140.055-372.575 g m-2 d). Os filmes reduziram o crescimento de microrganismos que vulgarmente colonizam património em pedra: Staphylococcus aureus (0.87-1.58-log de redução), Bacillus cereus (ca. 1-3-log de redução), Rhodotorula spp. (entre 0.73-1.27-log de redução a inibição total) e Penicillium chrysogenum (11.92-21.48% de inibição). Outro conjunto de formulações foi preparado para incrementar as propriedades das formulações CHGCA-TPP. Foi realizado um rastreio com soluções de quitosano com celulose microcristalina (MCC) ou nanocristais de celulose, e a formulação selecionada foi suplementada com óleo essencial de orégão (OEO) a 1% e 2%. Interações de ligação cruzada e a incorporação de OEO foram confirmadas por análise FTIR dos filmes, que eram pouco solúveis (15.74-16.85%), com baixas percentagens de swelling (16.10-28.22%) e molhabilidade relativamente baixa (> 70°). Estas formulações são um melhoramento das CHGCA-TPP, incluindo a sua ação antimicrobiana, uma vez que os filmes com 2% OEO inibiram totalmente o crescimento de S. aureus, Rhodotorula spp. e P. aeruginosa, induziram ca. 60% de inibição de P. chrysogenum e reduziram o crescimento de B. cereus. Por último, as duas formulações mais promissoras (CHGCA-TPP-a e 2-MCC-OEO-2) foram testadas em amostras de granito, calcário e mármore. Ambas polimerizaram nas superfícies das pedras, como confirmado por microscopia eletrónica de varrimento e FTIR, mas formaram revestimentos irregulares. O revestimento CHGCA-TPP-a reduziu a molhabilidade do granito e calcário, enquanto 2-MCC-OEO-2 provocou o mesmo de forma mais acentuada e em todos os tipos de pedra. Nenhum revestimento causou alterações de cor visíveis quando as formulações foram aplicadas com trincha. Ensaios antimicrobianos in vitro com amostras de pedra inoculadas com estirpes selecionadas mostrou que CHGCA-TPP-a inibiu o crescimento de B. cereus, Rhodotorula spp. e P. aeruginosa em granito após 7 dias para ca. 4 a 5 log10 (CFU mL -1 ). Pelo contrário, 2-MCC-OEO-2 reduziu as concentrações de células viáveis em todos os tipos de pedra para ca. 3 a 5 log10 (CFU mL -1 ) dependendo da estirpe. Ensaios antimicrobianos in situ, em que as amostras foram colocadas em ambiente exterior, mostrou que CHGCA-TPP-a não teve efeito inibitório sob as condições testadas, com concentrações de células viáveis iguais ou superiores às de amostras não revestidas, independentemente do modo de aplicação da formulação (deposição com uma micropipeta ou espalhamento com trincha) ou do número de tratamentos ao longo dos ensaios. Contudo, aplicações múltiplas de 2-MCC-OEO-2 ao longo do tempo com micropipeta reduziram a quantidade de células viáveis em granito e mármore, mas o mesmo ocorreu apenas em calcário quando a formulação foi aplicada com trincha. Em conclusão, este trabalho aumentou consideravelmente o conhecimento sobre a biocontaminação e diversidade dos microbiomas de esculturas de exterior do distrito do Porto (Portugal), podendo ajudar a delinear futuras estratégias de conservação. As formulações de quitosano testadas, especialmente aquelas com MCC e OEO, são uma base potencial para o desenvolvimento e otimização suplementar de novos revestimentos antimicrobianos de baixa toxicidade, rumo a estratégias mais sustentáveis de conservação preventiva do património cultural em pedra.
Esculturas em pedra e cimento de exterior são uma parte significativa do património cultural mundial. Consequentemente, a sua conservação é de grande importância, principalmente devido à sua vulnerabilidade à deterioração. A deterioração resulta de uma combinação de fatores que alteram e desvalorizam as obras de arte ao longo do tempo, incluindo os que resultam de mecanismos de biodeterioração originados pelo crescimento e atividade de microrganismos. É necessário desenvolver estratégias sustentáveis para desacelerar a proliferação de microrganismos e reduzir os impactos negativos no ambiente e saúde humana de biocidas tóxicos atualmente utilizados. Assim, esta tese procura contribuir para o desenvolvimento de revestimentos antimicrobianos, de baixa toxicidade e mais sustentáveis, para a conservação preventiva de património cultural em pedra, particularmente de esculturas de exterior. Primeiramente, foi realizada uma avaliação da biocontaminação e composição microbiológica de cinco esculturas de exterior, compostas por diferentes materiais e localizadas no distrito do Porto (Portugal). Foram testadas duas metodologias para recolha de amostras das esculturas de forma não invasiva e não destrutiva: zaragatoas de algodão (abordagem clássica) e criogéis de poli(2-hidroxietilmetacrilato) (método alternativo). A quantificação e determinação da viabilidade celular dos microrganismos recolhidos foi realizada por citometria de fluxo, que provou ser uma técnica analítica de interesse para estudos microbiológicos de património cultural. Ambos os métodos foram eficazes, apesar de concentrações superiores de microrganismos terem sido obtidas com zaragatoas, enquanto a visualização dos dados de células viáveis e não viáveis foi mais clara com criogéis. Por conseguinte, foram recolhidas amostras com zaragatoas para caracterizar as comunidades epilíticas bacterianas e fúngicas das esculturas. A sequenciação de alto rendimento revelou grande diversidade taxonómica e riqueza de espécies, incluindo em esculturas bem preservadas. A diversidade fúngica foi inferior à das comunidades bacterianas. Proteobacteria foi o principal grupo taxonómico comum a todas as esculturas. Foram também detetados Ascomycota em todas as esculturas e Basidiomycota formaram uma parte significativa dos microbiomas de granito, onde também foi encontrada uma abundância de microrganismos produtores de pigmentos. Adicionalmente, ensaios de colorimetria e de quantificação de adenosina trifosfato rapidamente identificaram áreas contaminadas das esculturas. A fase seguinte do trabalho incidiu sobre a preparação e caracterização de formulações de quitosano, para serem usadas como revestimento antimicrobiano para inibir o crescimento de microrganismos em esculturas. O primeiro conjunto de formulações consistiu em soluções de quitosano com ácido cítrico e diferentes concentrações de tripolifosfato de sódio (CHGCA-TPP), que foram polimerizadas em filmes para a sua caracterização. Espectroscopia de infravermelhos com transformada de Fourier (FTIR) confirmou o estabelecimento de interações de ligação cruzada, e os filmes exibiram molhabilidade (40.81-31.44°), solubilidade (43.64-55.14%) e swelling (123.36-75.17%) parciais em água, mas permitiram trocas de vapor de água devido à sua alta permeabilidade (140.055-372.575 g m-2 d). Os filmes reduziram o crescimento de microrganismos que vulgarmente colonizam património em pedra: Staphylococcus aureus (0.87-1.58-log de redução), Bacillus cereus (ca. 1-3-log de redução), Rhodotorula spp. (entre 0.73-1.27-log de redução a inibição total) e Penicillium chrysogenum (11.92-21.48% de inibição). Outro conjunto de formulações foi preparado para incrementar as propriedades das formulações CHGCA-TPP. Foi realizado um rastreio com soluções de quitosano com celulose microcristalina (MCC) ou nanocristais de celulose, e a formulação selecionada foi suplementada com óleo essencial de orégão (OEO) a 1% e 2%. Interações de ligação cruzada e a incorporação de OEO foram confirmadas por análise FTIR dos filmes, que eram pouco solúveis (15.74-16.85%), com baixas percentagens de swelling (16.10-28.22%) e molhabilidade relativamente baixa (> 70°). Estas formulações são um melhoramento das CHGCA-TPP, incluindo a sua ação antimicrobiana, uma vez que os filmes com 2% OEO inibiram totalmente o crescimento de S. aureus, Rhodotorula spp. e P. aeruginosa, induziram ca. 60% de inibição de P. chrysogenum e reduziram o crescimento de B. cereus. Por último, as duas formulações mais promissoras (CHGCA-TPP-a e 2-MCC-OEO-2) foram testadas em amostras de granito, calcário e mármore. Ambas polimerizaram nas superfícies das pedras, como confirmado por microscopia eletrónica de varrimento e FTIR, mas formaram revestimentos irregulares. O revestimento CHGCA-TPP-a reduziu a molhabilidade do granito e calcário, enquanto 2-MCC-OEO-2 provocou o mesmo de forma mais acentuada e em todos os tipos de pedra. Nenhum revestimento causou alterações de cor visíveis quando as formulações foram aplicadas com trincha. Ensaios antimicrobianos in vitro com amostras de pedra inoculadas com estirpes selecionadas mostrou que CHGCA-TPP-a inibiu o crescimento de B. cereus, Rhodotorula spp. e P. aeruginosa em granito após 7 dias para ca. 4 a 5 log10 (CFU mL -1 ). Pelo contrário, 2-MCC-OEO-2 reduziu as concentrações de células viáveis em todos os tipos de pedra para ca. 3 a 5 log10 (CFU mL -1 ) dependendo da estirpe. Ensaios antimicrobianos in situ, em que as amostras foram colocadas em ambiente exterior, mostrou que CHGCA-TPP-a não teve efeito inibitório sob as condições testadas, com concentrações de células viáveis iguais ou superiores às de amostras não revestidas, independentemente do modo de aplicação da formulação (deposição com uma micropipeta ou espalhamento com trincha) ou do número de tratamentos ao longo dos ensaios. Contudo, aplicações múltiplas de 2-MCC-OEO-2 ao longo do tempo com micropipeta reduziram a quantidade de células viáveis em granito e mármore, mas o mesmo ocorreu apenas em calcário quando a formulação foi aplicada com trincha. Em conclusão, este trabalho aumentou consideravelmente o conhecimento sobre a biocontaminação e diversidade dos microbiomas de esculturas de exterior do distrito do Porto (Portugal), podendo ajudar a delinear futuras estratégias de conservação. As formulações de quitosano testadas, especialmente aquelas com MCC e OEO, são uma base potencial para o desenvolvimento e otimização suplementar de novos revestimentos antimicrobianos de baixa toxicidade, rumo a estratégias mais sustentáveis de conservação preventiva do património cultural em pedra.
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Biodeterioration Cellulose crystals Chitosan Coatings Cultural heritage Biodeterioração Cristais de celulose Quitosano Revestimentos Património cultural
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