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Abstract(s)
Brettanomyces/Dekkera is a wine contaminating yeast responsible for serious economic losses due to the production of volatile phenols and the consequent negative impact on wine quality. Despite its importance to the wine industry it has remained poorly understood at the genetic level for a long period of time. In recent years, a genomic survey sequencing was implemented on Dekkera bruxellensis by some research groups providing resources for further investigation on this species. This thesis aims to make a review on how the acquired genetic knowledge has been applied for the development of molecular techniques for the detection, identification and enumeration of Brettanomyces/Dekkera in wine. Furthermore it is evaluated whether the accessibility to the whole genome sequence of D. bruxellensis allows a better understanding of the adaptation and survival mechanisms of this yeast in wine and the genetic bases of some relevant phenotypic traits.
It is extremely important to find rapid and effective ways to detect Brettanomyces/Dekkera in wine. Conventional methods are based on culturing the yeast on selective media, but these are laborious and time consuming, delaying corrective actions on the wine processing. Various studies based on molecular methods have been developed as alternatives to the traditional ones. They offer faster results and increased sensibility and specificity. However some limitations can be pointed out such as high detection limits and the quantification of non viable cells as is the case of QPCR. Beyond this, high cost equipment and skilled technicians are needed to execute the methods and for interpretation of the results.
Various genes and proteins were identified and related with the capacity of Brettanomyces/Dekkera to survive in the wine environment. These genes are responsible for glucose transport, carbon metabolism, anaerobic growth, fermenting characteristics, nitrate assimilation and osmotic stress response. Proteins involved in cell wall budding, adhesion and pseudohyphal growth were also identified and seem to be related with the capacity of cells to survive on the surface of grapes and barrels. The analysis of the genome sequence has also revealed one ORF that encodes a protein related to sulphite tolerance of Brettanonomyces/Dekkera. However, further studies on the expression and regulation of these genes are still necessary.
The production of volatile phenols is the major spoilage activity of Brettanonomyces/Dekkera. This requires the activity of two enzymes, the phenolic acid decarboxylase (PAD) and the vinylphenol reductase (VPR). The sequencing of Brettanomyces/Dekkera genome revealed the presence of the DbPAD gene. Two paralogous genes that encode PAD were identified and they differ in the gene expression and type of metabolism, which may explain the differences found between different isolates of Brettanomyces/Dekkera. The VPR protein has been isolated and purified but the gene sequence has yet to be found. Although the sequencing of the genome of Brettanomyces/Dekkera has brought new opportunities to better understand the behaviour of this yeast in wine, the molecular mechanisms are still poorly understood and further investigation is necessary.
Brettanomyces/Dekkera é uma levedura contaminante do vinho que tem originado importantes perdas económicas devido à produção de fenóis voláteis e ao consequente impacto negativo na qualidade do vinho. Apesar da sua importância para a indústria do vinho, durante um longo período de tempo foi pouco compreendida ao nível genético. Nos últimos anos, a sequenciação genómica de Dekkera bruxellensis tem sido implementada por alguns grupos de pesquisa, o que fornece recursos para uma investigação mais aprofundada sobre esta espécie. Esta tese tem como objetivo fazer uma avaliação sobre de que forma o conhecimento genético adquirido tem sido aplicado para o desenvolvimento de técnicas moleculares para a deteção, identificação e quantificação de Brettanomyces/Dekkera em vinho. Além disso, é avaliado se o acesso a toda a sequência genómica de D. bruxellensis permite uma melhor compreensão dos mecanismos de adaptação e sobrevivência desta levedura em vinho e as bases genéticas de algumas características fenotípicas. É extremamente importante encontrar formas rápidas e eficazes para detetar Brettanomyces/Dekkera em vinho. Os métodos convencionais são baseados no cultivo da levedura em meios seletivos, o que os tornam laboriosos e morosos, atrasando possíveis ações corretivas durante o processamento do vinho. Vários estudos baseados em métodos moleculares têm sido desenvolvidos como alternativa aos tradicionais. Estes oferecem resultados mais rápidos e um aumento de sensibilidade e de especificidade. No entanto, os métodos moleculares apresentam algumas limitações como limites de deteção elevados e a quantificação de células não viáveis como é no caso do QPCR. Para além destas limitações são necessários equipamentos de elevado custo e técnicos especializados para executar os métodos e interpretar dos resultados. Vários genes e proteínas foram identificados e relacionados com a capacidade de Brettanomyces / Dekkera sobreviver em ambiente vínico. Esses genes são responsáveis pelo transporte da glucose, metabolismo do carbono, crescimento anaeróbio, características fermentativas, assimilação do nitrato e resposta ao stress osmótico. Foram também identificadas proteínas envolvidas na gemulação, na adesão e no crescimento de pseudo-hifas que parecem estar relacionadas com a capacidade de sobrevivência na superfície das uvas e na superfície dos barris. A análise da sequência do genoma de Brettanomyces/Dekkera revelou a presença de um ORF que codifica a proteína que confere tolerância ao sulfito, contudo são necessários mais estudos de expressão e regulação destes genes. A produção de fenóis voláteis é a principal causa de deterioração dos vinhos por Brettanonomyces / Dekkera. A produção destes compostos requer a atividade de duas enzimas, a hidroxinamato descarboxilase (PAD) e a vinifenol reductase (VPR). A sequenciação do genoma de Brettanomyces/Dekkera revelou a presença do gene DbPAD. Foram ainda identificados dois genes parálogos que codificam o gene PAD, estes diferem na expressão génica e no tipo de metabolismo, o que pode explicar as diferenças encontradas nos diferentes isolados de Brettanomyces/Dekkera. A proteína da enzima VPR foi isolada e purificada, contudo sequência do gene ainda não foi encontrada. Embora a sequenciação do genoma de Brettanomyces/Dekkera tenha trazido novas oportunidades para compreender melhor o comportamento desta levedura em vinho, os mecanismos moleculares ainda estão mal compreendidos sendo necessária mais investigação.
Brettanomyces/Dekkera é uma levedura contaminante do vinho que tem originado importantes perdas económicas devido à produção de fenóis voláteis e ao consequente impacto negativo na qualidade do vinho. Apesar da sua importância para a indústria do vinho, durante um longo período de tempo foi pouco compreendida ao nível genético. Nos últimos anos, a sequenciação genómica de Dekkera bruxellensis tem sido implementada por alguns grupos de pesquisa, o que fornece recursos para uma investigação mais aprofundada sobre esta espécie. Esta tese tem como objetivo fazer uma avaliação sobre de que forma o conhecimento genético adquirido tem sido aplicado para o desenvolvimento de técnicas moleculares para a deteção, identificação e quantificação de Brettanomyces/Dekkera em vinho. Além disso, é avaliado se o acesso a toda a sequência genómica de D. bruxellensis permite uma melhor compreensão dos mecanismos de adaptação e sobrevivência desta levedura em vinho e as bases genéticas de algumas características fenotípicas. É extremamente importante encontrar formas rápidas e eficazes para detetar Brettanomyces/Dekkera em vinho. Os métodos convencionais são baseados no cultivo da levedura em meios seletivos, o que os tornam laboriosos e morosos, atrasando possíveis ações corretivas durante o processamento do vinho. Vários estudos baseados em métodos moleculares têm sido desenvolvidos como alternativa aos tradicionais. Estes oferecem resultados mais rápidos e um aumento de sensibilidade e de especificidade. No entanto, os métodos moleculares apresentam algumas limitações como limites de deteção elevados e a quantificação de células não viáveis como é no caso do QPCR. Para além destas limitações são necessários equipamentos de elevado custo e técnicos especializados para executar os métodos e interpretar dos resultados. Vários genes e proteínas foram identificados e relacionados com a capacidade de Brettanomyces / Dekkera sobreviver em ambiente vínico. Esses genes são responsáveis pelo transporte da glucose, metabolismo do carbono, crescimento anaeróbio, características fermentativas, assimilação do nitrato e resposta ao stress osmótico. Foram também identificadas proteínas envolvidas na gemulação, na adesão e no crescimento de pseudo-hifas que parecem estar relacionadas com a capacidade de sobrevivência na superfície das uvas e na superfície dos barris. A análise da sequência do genoma de Brettanomyces/Dekkera revelou a presença de um ORF que codifica a proteína que confere tolerância ao sulfito, contudo são necessários mais estudos de expressão e regulação destes genes. A produção de fenóis voláteis é a principal causa de deterioração dos vinhos por Brettanonomyces / Dekkera. A produção destes compostos requer a atividade de duas enzimas, a hidroxinamato descarboxilase (PAD) e a vinifenol reductase (VPR). A sequenciação do genoma de Brettanomyces/Dekkera revelou a presença do gene DbPAD. Foram ainda identificados dois genes parálogos que codificam o gene PAD, estes diferem na expressão génica e no tipo de metabolismo, o que pode explicar as diferenças encontradas nos diferentes isolados de Brettanomyces/Dekkera. A proteína da enzima VPR foi isolada e purificada, contudo sequência do gene ainda não foi encontrada. Embora a sequenciação do genoma de Brettanomyces/Dekkera tenha trazido novas oportunidades para compreender melhor o comportamento desta levedura em vinho, os mecanismos moleculares ainda estão mal compreendidos sendo necessária mais investigação.