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Strategies to overcome industrial stress factors in engineered Saccharomyces Cerevisiae and impact on bioreactor fermentation
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Authors
Abstract(s)
Saccharomyces cerevisiae fermentation is a valuable process to produce industrially relevant compounds sustainably and cost-effectively. However, biomolecule production by fermentation is usually impaired by harsh environmental conditions that may lead to yeast stress resulting in stuck or sluggish fermentations. Thus, enhance yeast tolerance to environmental stresses through genetic engineering or culture media supplementation may improve biomolecule productivity. Accordingly, this thesis focuses on the study of solutions to overcome the impact of oxidative and ethanol stresses on β-farnesene producer yeast in bioreactor fermentation. Culture medium supplementation with antioxidant compounds is a strategy commonly applied to overcome yeast oxidative stress. Therefore, the impact of an antioxidant peptide extract (APE), obtained from industrial spent yeast, was evaluated in the fermentation of S. cerevisiae in the presence and absence of the oxidative stress inducer hydrogen peroxide (H2O2). Under 2 mM of H2O2 exposure, the addition of 0.7 g/L APE led to the reduction of intracellular reactive oxygen species (ROS) levels up to 3-fold in shake-flasks and 1.7-fold in batch bioreactor fermentations. As a result, cell density and biomolecule concentration were enhanced up to 2-fold and 2.8-fold in shake-flasks, while, in bioreactors were increased up to 1.5-fold and up to 1.6-fold, respectively. Culture medium supplementation with APE showed to be a promising strategy to overcome yeast oxidative stress and improve βfarnesene production, while allowing for the valorisation of biomass waste as a sustainable and eco-friendly solution for the biotechnology industry. Yeast stress tolerance is also often improved using genetic engineering. Since yeast membrane is the first target of ethanol toxicity, improving the synthesis of mono-unsaturated fatty acids can be a good strategy to overcome ethanol stress. The effect of overexpressing OLE1 and TniNPVE genes, coding homologous and insect delta-9 fatty acids desaturases, respectively, on oleic acid production was evaluated in strains modified with these genes under a range of different pGAL promoter strengths (pGAL3 << pGAL2 < pGAL10 < pGAL1). OLE1 overexpression with pGAL10 (pGAL10-OLE1) increased oleic acid content between 30.9% and 77.3% compared to control, while TniNPVE overexpression with pGAL2 (pGAL2-TniNPVE) enhanced oleic acid between 18.4 and 34.7% in shake-flasks fermentations. Additionally, pGAL10-OLE1 and pGAL2-TniNPVE grew faster than control strain with a max 6 to 7% higher and produced more 55% of -farnesene. Besides, pGAL10-OLE1 and pGAL2-TniNPVE were exposed to 12.5% and 15% ethanol at different stages of fermentation and demonstrated to be more sensitive to ethanol than the control strain. Therefore, the higher oleic acid levels obtained by genetic modification improved yeast growth and productivity but not its resistance to ethanol. To clarify if high levels of mono-unsaturated fatty acids content can positively affect yeast growth and productivity at a larger scale, fed-batch fermentations with pGAL10-OLE1 were conducted for 13 days in 2-L bioreactors. pGAL10-OLE1 presented increments up to 59.5% in oleic acid and 49.1% in palmitoleic acid relative to control. These changes in monounsaturated fatty acids content resulted in β-farnesene productivity improvements between 5.5% (day 13) and 21.2% (day 2). In conclusion, improve yeast tolerance to oxidative stress, by reducing ROS accumulation with APE medium supplementation, benefited yeast growth and productivity. In contrast, OLE1 overexpression did not improve yeast tolerance to ethanol. However, the increase in mono-unsaturated fatty acids content led to higher farnesene productivity, which can benefit the industrial production of the biomolecule.
A produção de compostos industrialmente relevantes de forma sustentável e económica é possível através da fermentação de Saccharomyces cerevisiae. Contudo, a produção de biomoléculas durante a fermentação é habitualmente limitada por condições adversas que provocam stress na levedura, resultando em fermentação presa ou lenta. Assim, aumentar a tolerância da levedura a stresses ambientais por modificações genéticas ou por suplementação do meio de cultura pode melhorar a produtividade das biomoléculas. Deste modo, esta tese foca-se no estudo de soluções para diminuir o stress oxidativo e do etanol numa levedura produtora de β-farneseno em fermentações em biorreator. A adição de compostos antioxidantes ao meio de cultura é uma estratégia comum para reduzir o stress oxidativo. Como tal, o impacto de um extrato antioxidante de péptidos (APE), obtido a partir de levedura excedentária, na fermentação de S. cerevisiae foi avaliado na presença e ausência de peróxido de hidrogénio (H2O2). Na presença de H2O2 a 2 mM, a adição de 0.7 g/L de APE reduziu os níveis intracelulares de espécies reativas ao oxigénio (ROS) até 3 vezes em matrazes e 1.7 vezes em fermentação descontínua em biorreatores. Como resultado, a densidade celular e a concentração de β-farneseno aumentaram até 2.0 e 2.8 vezes nos matrazes, e até 1.5 e 1.6 vezes nos biorreatores, respetivamente. A adição de APE ao meio de cultura demonstrou ser uma estratégia promissora para combater o stress oxidativo, melhorar a produção de β-farneseno, e ao mesmo tempo valorizar os resíduos de biomassa, promovendo uma solução sustentável e ecológica para as empresas de biotecnologia. A modificação genética de leveduras é uma técnica frequentemente usada para melhorar a sua capacidade de tolerância ao stress. Uma vez que a membrana da levedura é o primeiro alvo do etanol, aumentar a síntese de ácidos gordos monoinsaturados pode ser uma boa estratégia para combater o stress do etanol. Assim, o efeito da sobreexpressão dos genes OLE1 e TniNPVE, que codificam as desaturases de ácidos gordos delta-9 homóloga e de inseto, respetivamente, na produção de ácido oleico foi avaliado em estirpes modificadas com esses genes sob uma gama de diferentes forças do promotor pGAL (pGAL3 << pGAL2 < pGAL10 < pGAL1). A sobrexpressão de OLE1 com o pGAL10 (pGAL10-OLE1) aumentou os níveis de ácido oleico entre 30.9% e 77.3% relativamente ao controlo, enquanto a sobreexpressão de TniNPVE com o pGAL2 (pGAL2-TniNPVE) aumentou o ácido oleico entre 18.4% e 34.7% em fermentações em matrazes. Além disso, pGAL10-OLE1 e pGAL2-TniNPVE cresceram mais rápido que a estirpe controlo com uma max 6 a 7% maior e produziram mais 55% de β-farneseno. Além disso, pGAL10-OLE1 e pGAL2-TniNPVE foram expostas a 12.5% e 15% de etanol em diferentes estágios da fermentação e demonstraram ser mais sensíveis ao etanol que o controlo. Os aumentos obtidos nos níveis de ácido oleico, através das modificações genéticas, melhoraram o crescimento e a produtividade da levedura, mas não a sua resistência ao etanol. Para clarificar se níveis mais altos de ácidos gordos monoinsaturados também beneficiam o crescimento e a produtividade da levedura em escalas maiores, foram realizadas fermentações semi-contínuas de 13 dias em biorreatores de 2-L com pGAL10- OLE1. pGAL10-OLE1 apresentou aumentos até 59.5% de ácido oleico e 49.1% de ácido palmitoleico em relação ao controlo. Estas alterações nos níveis de ácidos gordos monoinsaturados resultaram em melhorias na produção de β-farneseno entre 5.5% (dia 13) e 21.2% (dia 2). Concluindo, melhorar a tolerância da levedura ao stress oxidativo reduzindo a acumulação de ROS por suplementação do meio com APE, beneficiou o crescimento e a produtividade da levedura. Porém, a sobreexpressão de OLE1 não melhorou a tolerância da levedura ao etanol. Todavia, o aumento obtido no conteúdo de ácidos gordos monoinsaturados, resultou no aumento da produtividade de β-farneseno, o que pode ser vantajoso para a produção industrial da biomolécula.
A produção de compostos industrialmente relevantes de forma sustentável e económica é possível através da fermentação de Saccharomyces cerevisiae. Contudo, a produção de biomoléculas durante a fermentação é habitualmente limitada por condições adversas que provocam stress na levedura, resultando em fermentação presa ou lenta. Assim, aumentar a tolerância da levedura a stresses ambientais por modificações genéticas ou por suplementação do meio de cultura pode melhorar a produtividade das biomoléculas. Deste modo, esta tese foca-se no estudo de soluções para diminuir o stress oxidativo e do etanol numa levedura produtora de β-farneseno em fermentações em biorreator. A adição de compostos antioxidantes ao meio de cultura é uma estratégia comum para reduzir o stress oxidativo. Como tal, o impacto de um extrato antioxidante de péptidos (APE), obtido a partir de levedura excedentária, na fermentação de S. cerevisiae foi avaliado na presença e ausência de peróxido de hidrogénio (H2O2). Na presença de H2O2 a 2 mM, a adição de 0.7 g/L de APE reduziu os níveis intracelulares de espécies reativas ao oxigénio (ROS) até 3 vezes em matrazes e 1.7 vezes em fermentação descontínua em biorreatores. Como resultado, a densidade celular e a concentração de β-farneseno aumentaram até 2.0 e 2.8 vezes nos matrazes, e até 1.5 e 1.6 vezes nos biorreatores, respetivamente. A adição de APE ao meio de cultura demonstrou ser uma estratégia promissora para combater o stress oxidativo, melhorar a produção de β-farneseno, e ao mesmo tempo valorizar os resíduos de biomassa, promovendo uma solução sustentável e ecológica para as empresas de biotecnologia. A modificação genética de leveduras é uma técnica frequentemente usada para melhorar a sua capacidade de tolerância ao stress. Uma vez que a membrana da levedura é o primeiro alvo do etanol, aumentar a síntese de ácidos gordos monoinsaturados pode ser uma boa estratégia para combater o stress do etanol. Assim, o efeito da sobreexpressão dos genes OLE1 e TniNPVE, que codificam as desaturases de ácidos gordos delta-9 homóloga e de inseto, respetivamente, na produção de ácido oleico foi avaliado em estirpes modificadas com esses genes sob uma gama de diferentes forças do promotor pGAL (pGAL3 << pGAL2 < pGAL10 < pGAL1). A sobrexpressão de OLE1 com o pGAL10 (pGAL10-OLE1) aumentou os níveis de ácido oleico entre 30.9% e 77.3% relativamente ao controlo, enquanto a sobreexpressão de TniNPVE com o pGAL2 (pGAL2-TniNPVE) aumentou o ácido oleico entre 18.4% e 34.7% em fermentações em matrazes. Além disso, pGAL10-OLE1 e pGAL2-TniNPVE cresceram mais rápido que a estirpe controlo com uma max 6 a 7% maior e produziram mais 55% de β-farneseno. Além disso, pGAL10-OLE1 e pGAL2-TniNPVE foram expostas a 12.5% e 15% de etanol em diferentes estágios da fermentação e demonstraram ser mais sensíveis ao etanol que o controlo. Os aumentos obtidos nos níveis de ácido oleico, através das modificações genéticas, melhoraram o crescimento e a produtividade da levedura, mas não a sua resistência ao etanol. Para clarificar se níveis mais altos de ácidos gordos monoinsaturados também beneficiam o crescimento e a produtividade da levedura em escalas maiores, foram realizadas fermentações semi-contínuas de 13 dias em biorreatores de 2-L com pGAL10- OLE1. pGAL10-OLE1 apresentou aumentos até 59.5% de ácido oleico e 49.1% de ácido palmitoleico em relação ao controlo. Estas alterações nos níveis de ácidos gordos monoinsaturados resultaram em melhorias na produção de β-farneseno entre 5.5% (dia 13) e 21.2% (dia 2). Concluindo, melhorar a tolerância da levedura ao stress oxidativo reduzindo a acumulação de ROS por suplementação do meio com APE, beneficiou o crescimento e a produtividade da levedura. Porém, a sobreexpressão de OLE1 não melhorou a tolerância da levedura ao etanol. Todavia, o aumento obtido no conteúdo de ácidos gordos monoinsaturados, resultou no aumento da produtividade de β-farneseno, o que pode ser vantajoso para a produção industrial da biomolécula.
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Keywords
Saccharomyces cerevisiae Oxidative stress Ethanol stress Bioreactor fermentation Lipids Stress oxidativo Stress do etanol Fermentação em biorreatores Lípidos