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Abstract(s)
Yeast-based biotechnology companies face an increasing challenge in deriving economic value from the byproducts generated through fermentative processes. Furthermore, growing environmental concerns are pushing companies toward adopting more sustainable and closed-loop economic systems, which aim to reduce waste production and find ways to valorize these byproducts. Spent yeasts obtained from fermentations represent an unused source of valuable bioactive compounds with potential applications across various industries, from food to pharmaceuticals. This PhD work focuses on the extraction, purification, and chemical modification of Saccharomyces cerevisiae glucans, complex polysaccharides composed of a mixture of α/β glycosidic linkages, to explore their biological properties related to skin health through in vitro assays and human skin ex vivo models. For this, the first stage of this thesis concentrated on developing a novel extraction and purification methodology to isolate glucans from two different S. cerevisiae strains: an engineered strain designed for biotechnology fermentation provided by Amyris and a wild strain produced in a lab-scale fermentation process. Two water-insoluble extracts were obtained, which displayed a high glucose purity and a similar chemical structure. Due to their water-insolubility, an extra chemical modification (carboxymethylation) was performed, resulting in two water-soluble extracts with new functional groups added to the polysaccharide chain. Once these extracts were obtained, comprising two water insoluble and two functionalized extracts, a safety assessment was conducted to ensure that glucans could be safely used as chemical ingredient for skin application. This assessment demonstrated that glucans had no genotoxic effect, no skin sensitization capacity, and no impact on the skin microbiota naturally present on healthy female skin. In the second stage of this study, both water-insoluble and carboxymethylated extracts were analyzed through in vitro assays to assess their biological properties for potential skin application. It was observed that glucans were capable of attenuating cytokine release (IL-1α/IL-6/IL-8) in a cell-induced inflammation model, using bacterial lipopolysaccharides (LPS) and pollution particle matter (PM), involving keratinocytes (HACAT) and macrophage-like THP-1 cells (mTHP-1). Using HACAT cells, it was also demonstrated that these extracts, with water-insoluble glucans showing a higher bioactive potential, effectively reduced intracellular reactive oxygen species (ROS) generation induced by PM and promoted cell migration in a wound healing assay. In the final stage of this thesis, all the extracts tested until now were individually incorporated into a cream formulation and applied in newly developed human skin ex vivo models to evaluate potential skin-related biological properties. Initially, all the creams containing glucans were applied to skin explants, and its permeability and impact on skin viability were assessed, with all the formulations showing no adverse effects on the skin tissue. It was also analyzed whether these formulated creams affected the presence of skin immune cells (Langerhans and M1/M2 macrophage cells) in the explants, and it was observed that some of the samples had the ability to modulate, either by increasing or reducing, the number of these cells present in the skin. After analyzing the skin’s structural components, it was also perceived that all cream formulations had the capacity to increase collagen deposition in the dermal layer, specifically collagen type-I. From a therapeutic perspective, it was demonstrated that the formulations tested had the capacity to reduce cytokine production (IL-1α/IL-6) when skin explants were exposed to SDS and PM, suggesting a potential application as an anti-inflammatory agent for topical use. Additionally, it was also shown that most of the cream formulations had the capacity to induce epidermal migration and wound closure, supporting the potential use of glucans as a wound repair agent. Overall, spent yeast glucans were demonstrated to be a safe and bioactive choice with various skin-related properties for potential skin application, noting that yeast glucans capacity is directly influenced by cell-to-cell interactions. Moreover, more studies are needed to explore the ways in which glucans can be applied to other skin-related areas, such as managing skin diseases like atopic dermatitis or combating skin viral infections like herpes simplex.
As empresas de biotecnologia focadas no uso de leveduras para produção de compostos enfrentam um desafio crescente na criação de valor económico a partir dos subprodutos gerados no processo fermentativo. Além disso, fatores ambientais sem precedentes estão a forçar as empresas a adotar um sistema de economia circular mais sustentável, produzindo menos resíduos ou encontrando novas formas de os valorizar. As leveduras residuais obtidas após a fermentação, que normalmente não possuem valor, são uma fonte importante de compostos bioativos que podem ser aplicados a uma variedade de produtos, desde alimentos até às indústrias farmacêuticas. Como tal, este doutoramento está focado na extração, purificação e modificação química de glucanas da levedura Saccharomyces cerevisiae, um polissacarídeo composto por uma mistura de ligações glicosídicas α/β, para explorar ainda mais as propriedades biológicas relacionadas à pele, através de ensaios celulares in vitro ou através de modelos ex vivo usando pele humana. Para isso, a primeira etapa desta tese concentrou-se na implementação de uma nova metodologia de extração e purificação para isolar glucanas de duas estirpes diferentes de S. cerevisiae: uma estirpe geneticamente desenhada fornecida pela Amyris e uma estirpe selvagem produzida à escala laboratorial. Dois extratos insolúveis foram obtidos com uma alta pureza de glucose e estrutura quimicamente semelhante. Devido à sua insolubilidade em água, foi realizada uma modificação química adicional (carboximetilação), resultando em dois extratos funcionalizados solúveis em água. Uma vez obtidos esses extratos, dois extratos insolúveis e dois carboximetilados, foi feita uma avaliação para garantir que as glucanas não representam um risco ao serem aplicadas na pele. Esta avaliação não demonstrou nenhum efeito genotóxico, nenhuma capacidade sensitizante e nenhum impacto na microbiota naturalmente presente em pele feminina. Na segunda etapa deste estudo, os extratos insolúveis e carboximetilados foram analisados através de ensaios in vitro quanto às suas potenciais propriedades biológicas. Observou-se que as glucanas foram capazes de atenuar a produção de citocinas (IL-1α/IL 6/IL-8) num modelo de inflamação, utilizando lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) e partículas de poluição (PM), induzido em células queratinócitos (HACAT) e células semelhantes a macrófagos (mTHP-1). Utilizando as células HACAT, também foi demonstrado que esses extratos, com as glucanas insolúveis a demonstrar um maior potencial bioativo, reduziram com sucesso a formação intracelular de espécies reativas de oxigénio (ROS) induzida por PM como também promoveram a migração celular de queratinócitos num ensaio de cicatrização de feridas. Na fase final desta tese, todos os extratos testados foram incorporados individualmente numa formulação de creme para ser aplicada em modelos ex vivo de pele humana, desenvolvidos no sentido de avaliar potenciais propriedades biológicas relacionadas com a pele. Inicialmente, as formulações foram aplicadas em explantes de pele e foi avaliada a sua permeabilidade bem como o impacto na viabilidade da pele, sendo que todas as formulações não mostraram influência na sua viabilidade. Em seguida, foi analisado se os cremes formulados afetavam a presença de células imunes da pele (Langerhans e macrófagos M1/M2), onde foi observado que algumas das amostras possuíam capacidade de modular, aumentando ou reduzindo, o número destas células presentes na pele. Após analisar as componentes estruturais da pele, percebeu-se também que todas as formulações tinham a capacidade de aumentar a deposição de colagénio na camada dérmica, especificamente aumentava o colagénio do tipo-I. Numa vertente mais terapêutica, foi demonstrado que estes cremes possuíam capacidade de reduzir a produção de citocinas (IL-1α/IL-6) após a exposição da pele a SDS e PM, mostrando um grande potencial para usar as glucanas como agente anti-inflamatório para aplicação tópica. Adicionalmente, também foi demonstrado que a maior parte destes cremes detinha capacidade de induzir a migração epidérmica, demonstrando um potencial uso das glucanas como regenerador de feridas. Em suma, as glucanas de levedura usadas neste estudo demonstraram ser uma molécula segura e com múltiplas propriedades bioativas para aplicação na pele. No entanto, é de realçar que a capacidade das glucanas de levedura é diretamente afetada pelas comunicações célula a célula. Adicionalmente, mais estudos devam ser feitos para analisar de que forma as glucanas podem ser aplicadas noutras áreas relacionadas com a pele, incluindo em doenças como a dermatite atópica ou no tratamento de infeções virais da pele, como o herpes simplex.
As empresas de biotecnologia focadas no uso de leveduras para produção de compostos enfrentam um desafio crescente na criação de valor económico a partir dos subprodutos gerados no processo fermentativo. Além disso, fatores ambientais sem precedentes estão a forçar as empresas a adotar um sistema de economia circular mais sustentável, produzindo menos resíduos ou encontrando novas formas de os valorizar. As leveduras residuais obtidas após a fermentação, que normalmente não possuem valor, são uma fonte importante de compostos bioativos que podem ser aplicados a uma variedade de produtos, desde alimentos até às indústrias farmacêuticas. Como tal, este doutoramento está focado na extração, purificação e modificação química de glucanas da levedura Saccharomyces cerevisiae, um polissacarídeo composto por uma mistura de ligações glicosídicas α/β, para explorar ainda mais as propriedades biológicas relacionadas à pele, através de ensaios celulares in vitro ou através de modelos ex vivo usando pele humana. Para isso, a primeira etapa desta tese concentrou-se na implementação de uma nova metodologia de extração e purificação para isolar glucanas de duas estirpes diferentes de S. cerevisiae: uma estirpe geneticamente desenhada fornecida pela Amyris e uma estirpe selvagem produzida à escala laboratorial. Dois extratos insolúveis foram obtidos com uma alta pureza de glucose e estrutura quimicamente semelhante. Devido à sua insolubilidade em água, foi realizada uma modificação química adicional (carboximetilação), resultando em dois extratos funcionalizados solúveis em água. Uma vez obtidos esses extratos, dois extratos insolúveis e dois carboximetilados, foi feita uma avaliação para garantir que as glucanas não representam um risco ao serem aplicadas na pele. Esta avaliação não demonstrou nenhum efeito genotóxico, nenhuma capacidade sensitizante e nenhum impacto na microbiota naturalmente presente em pele feminina. Na segunda etapa deste estudo, os extratos insolúveis e carboximetilados foram analisados através de ensaios in vitro quanto às suas potenciais propriedades biológicas. Observou-se que as glucanas foram capazes de atenuar a produção de citocinas (IL-1α/IL 6/IL-8) num modelo de inflamação, utilizando lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) e partículas de poluição (PM), induzido em células queratinócitos (HACAT) e células semelhantes a macrófagos (mTHP-1). Utilizando as células HACAT, também foi demonstrado que esses extratos, com as glucanas insolúveis a demonstrar um maior potencial bioativo, reduziram com sucesso a formação intracelular de espécies reativas de oxigénio (ROS) induzida por PM como também promoveram a migração celular de queratinócitos num ensaio de cicatrização de feridas. Na fase final desta tese, todos os extratos testados foram incorporados individualmente numa formulação de creme para ser aplicada em modelos ex vivo de pele humana, desenvolvidos no sentido de avaliar potenciais propriedades biológicas relacionadas com a pele. Inicialmente, as formulações foram aplicadas em explantes de pele e foi avaliada a sua permeabilidade bem como o impacto na viabilidade da pele, sendo que todas as formulações não mostraram influência na sua viabilidade. Em seguida, foi analisado se os cremes formulados afetavam a presença de células imunes da pele (Langerhans e macrófagos M1/M2), onde foi observado que algumas das amostras possuíam capacidade de modular, aumentando ou reduzindo, o número destas células presentes na pele. Após analisar as componentes estruturais da pele, percebeu-se também que todas as formulações tinham a capacidade de aumentar a deposição de colagénio na camada dérmica, especificamente aumentava o colagénio do tipo-I. Numa vertente mais terapêutica, foi demonstrado que estes cremes possuíam capacidade de reduzir a produção de citocinas (IL-1α/IL-6) após a exposição da pele a SDS e PM, mostrando um grande potencial para usar as glucanas como agente anti-inflamatório para aplicação tópica. Adicionalmente, também foi demonstrado que a maior parte destes cremes detinha capacidade de induzir a migração epidérmica, demonstrando um potencial uso das glucanas como regenerador de feridas. Em suma, as glucanas de levedura usadas neste estudo demonstraram ser uma molécula segura e com múltiplas propriedades bioativas para aplicação na pele. No entanto, é de realçar que a capacidade das glucanas de levedura é diretamente afetada pelas comunicações célula a célula. Adicionalmente, mais estudos devam ser feitos para analisar de que forma as glucanas podem ser aplicadas noutras áreas relacionadas com a pele, incluindo em doenças como a dermatite atópica ou no tratamento de infeções virais da pele, como o herpes simplex.
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Keywords
Spent yeast valorization Sustainable biotechnology Glucans extraction Carboxymethylation Biological properties Skin health Skin application Valorização de levedura residual Biotecnologia sustentável Extração de glucanas Carboximetilação Propriedades biológicas Saúde da pele Aplicação em pele