Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
The present work describes the development of a sequential injection system for the
determination of alkaline phosphatase activity, after solid phase extraction/preconcentration and also
the determination of phosphate in natural waters and plant roots.
The determination of alkaline phosphatase activity was based on the sepctrophotometric
detection of a colored product (p-nitrophenol), resulting from the catalysis of a non colored substrate
(p-nitrophenyl phosphate). Due to the low levels of alkaline phosphatase in waters, it was
preconcentrated in a NTA Superflow resin charged with Zn2+ ions. This was possible due to the
enzyme necessity for metals in its active site.
The phosphate determination was based on the spectrophotometric determination of a colored
complex (molybdenum blue), resulting from the formation of the complex of orthophosphate with
molybdate, followed by its reduction with ascorbic acid.
The proposed methodology allowed the determination of alkaline phosphatase activity within a
range between 0.044 – 0.441 unit cm-3 and 19 – 280 μmol dm-3 pNP. A determination rate of 17 h-1
and detection limits of 0.025 unit cm-3 and 1.9 μmol dm-3 pNP were obtained.
Phosphate determination was also possible to perform within a range between 0.98 – 49.9 μmol
dm-3 H2PO4
-, and with a detection limit of 0.29 μmol dm-3 H2PO4
-. A determination rate of 32 h-1 was
obtained
No âmbito desta dissertação, desenvolveu-se uma metodologia de análise por injecção sequencial para a determinação da actividade da enzima fosfatase alcalina após pré-concentração e de fosfato em diferentes amostras de águas e raízes. A determinação da actividade da enzima fosfatase alcalina foi realizada com base na detecção espectrofotométrica do produto formado (p-nitrofenol) após degradação enzimática do substrato pnitrofenil fosfato. Devido aos seus baixos valores em águas, a enzima foi pré-concentrada numa resina (NTA Superflow) previamente carregada com iões Zn2+. Esta imobilização foi conseguida através do facto de a enzima ser uma metaloproteína. A determinação de fosfato foi realizada através da detecção espectrofotométrica do complexo azul de molibdénio. A reacção do azul de molibdénio ocorre pela formação de um complexo entre o fosfato inorgânico e o molibdato, seguida da redução pelo ácido ascórbico. O sistema desenvolvido permitiu a determinação da actividade da enzima fosfatase alcalina num intervalo de concentrações compreendido entre 0.044 – 0.441 unit cm-3 e 19 – 280 μmol dm-3 pNP. Obtiveram-se os limites de detecção de 0.025 unit cm-3 e 1.9 μmol dm-3 pNP com um ritmo de determinação de 17 h-1. A determinação do anião fosfato foi também possível num intervalo de concentração de 0.98 – 49.9 μmol dm-3 H2PO4 -, com um limite de detecção de 0.29 μmol dm-3 H2PO4 -. O ritmo de determinação de fosfato foi de 32 h-1.
No âmbito desta dissertação, desenvolveu-se uma metodologia de análise por injecção sequencial para a determinação da actividade da enzima fosfatase alcalina após pré-concentração e de fosfato em diferentes amostras de águas e raízes. A determinação da actividade da enzima fosfatase alcalina foi realizada com base na detecção espectrofotométrica do produto formado (p-nitrofenol) após degradação enzimática do substrato pnitrofenil fosfato. Devido aos seus baixos valores em águas, a enzima foi pré-concentrada numa resina (NTA Superflow) previamente carregada com iões Zn2+. Esta imobilização foi conseguida através do facto de a enzima ser uma metaloproteína. A determinação de fosfato foi realizada através da detecção espectrofotométrica do complexo azul de molibdénio. A reacção do azul de molibdénio ocorre pela formação de um complexo entre o fosfato inorgânico e o molibdato, seguida da redução pelo ácido ascórbico. O sistema desenvolvido permitiu a determinação da actividade da enzima fosfatase alcalina num intervalo de concentrações compreendido entre 0.044 – 0.441 unit cm-3 e 19 – 280 μmol dm-3 pNP. Obtiveram-se os limites de detecção de 0.025 unit cm-3 e 1.9 μmol dm-3 pNP com um ritmo de determinação de 17 h-1. A determinação do anião fosfato foi também possível num intervalo de concentração de 0.98 – 49.9 μmol dm-3 H2PO4 -, com um limite de detecção de 0.29 μmol dm-3 H2PO4 -. O ritmo de determinação de fosfato foi de 32 h-1.