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Publicação
Detergent-free supercritical carbon dioxide : assisted protocol for the production of sustainable and highly preserved decellularized porcine meniscus for orthopedic applications
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Autores
Resumo(s)
The development of biologically functional scaffolds for meniscal applications using the extracellular matrix (ECM) as a source has been shown to be a promising alternative to tissue engineered strategies. Therefore, there is a need to achieve efficient decellularization strategies that can effectively eliminate cellular and genetic materials to minimize immunogenic responses, while maximally preserving the ECM to support subsequent cellular activities essential for tissue regeneration. Conventional decellularization methods generally rely on harsh chemicals that are associated with ECM damage, cytotoxic residues, and prolonged processing times, compromising tissue integrity and biocompatibility. These limitations have driven the exploration of supercritical carbon dioxide (scCO2)4a green and minimally invasive technology4as an alternative decellularization agent to develop faster, more cost-effective, and environmentally sustainable approaches. This study evaluated a series of scCO2-assisted decellularization protocols, where operational parameters including number of cycles, depressurization speed, applied pressures, exposure time, co-solvent application, as well as washing strategies with distinct solvents, washing modes, and physical interventions were tested. Decellularization efficiency was assessed via quantification of residual dsDNA. Moreover, ECM preservation was assessed using biochemical assays for glycosaminoglycans (GAGs), soluble collagen, and insoluble collagen, alongside Fourier transform infrared spectroscopy with attenuated total reflectance (FTIR-ATR) and the corresponding chemometric analysis. These assessments for ECM preservation were further conducted after sterilization applying scCO2 with the additive NovaKillTM, a mixture comprising peracetic acid (PAA) and hydrogen peroxide (H2O2). The scCO2-assisted protocol4employing nine cycles at 160 bars and integrating freeze-thaw, direct sonication with an ultrasonic processor, and lyophilization4 achieved the highest decellularization efficiency, with residual dsDNA of 88.74 ± 10.25 ng/mg of dry sample. Additionally, biochemical assay results demonstrated great preservation of ECM, with only minimal degradation suggested by spectroscopic analysis. Following sterilization, no significant differences were observed in the ECM quantification results and FTIR spectral analysis, indicating an optimal ECM preservation. These findings highlight the potential of generating decellularized ECM (dECM) by scCO2-assisted approaches as a promising candidate for advanced meniscal regenerative applications.
O desenvolvimento de scaffolds biologicamente funcionais para aplicações meniscais, utilizando a matriz extracelular (ECM) como fonte, tem-se revelado uma alternativa promissora às estratégias de engenharia tecidular. Assim, torna-se necessário desenvolver estratégias de descelularização eficientes que consigam eliminar de forma eficaz os materiais celulares e genéticos, minimizando as respostas imunogénicas e, ao mesmo tempo, preservar ao máximo a ECM, de modo a apoiar as atividades celulares subsequentes essenciais para a regeneração tecidular. Os métodos convencionais de descelularização baseiam-se geralmente na utilização de agentes químicos agressivos, associados à degradação da ECM, à presença de resíduos citotóxicos e a tempos de processamento prolongados, comprometendo a integridade e biocompatibilidade do tecido. Estas limitações têm impulsionado a exploração do dióxido de carbono supercrítico (scCO₂)4uma tecnologia verde e minimamente invasiva4como agente alternativo de descelularização, visando o desenvolvimento de abordagens mais rápidas, económicas e sustentáveis do ponto de vista ambiental. Neste estudo, foi avaliada uma série de protocolos de descelularização assistidos por scCO₂, nos quais foram testados parâmetros operacionais, incluindo o número de ciclos, a velocidade de despressurização, as pressões aplicadas, o tempo de exposição, a utilização de co-solventes, bem como estratégias de lavagem com diferentes solventes, modos de lavagem e intervenções físicas. A eficiência de descelularização foi avaliada através da quantificação de DNA de dupla hélice (dsDNA) residual. A preservação da ECM foi analisada por meio de ensaios bioquímicos para quantificação de glicosaminoglicanos (GAGs), colagénio solúvel e colagénio insolúvel, em paralelo com espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier com reflectância total atenuada (FTIR-ATR) e respetiva análise quimiométrica. Estas avaliações foram também realizadas após esterilização com scCO₂ e o aditivo NovaKillTM, uma mistura composta por ácido peracético (PAA) e peróxido de hidrogénio (H₂O₂). O protocolo assistido por scCO₂4 envolvendo nove ciclos a 160 bar e integrando ciclos de congelação-descongelação, sonicação direta com processador ultrassónico e liofilização4demonstrou a maior eficiência de descelularização, com um conteúdo residual de dsDNA de 88,74 ± 10,25 ng/mg de amostra seca. Adicionalmente, os resultados dos ensaios bioquímicos demonstraram uma preservação significativa da ECM, com apenas degradações mínimas sugeridas pela análise espectroscópica. Após esterilização, não foram observadas diferenças significativas nos resultados da quantificação da ECM nem na análise espectral por FTIR, indicando uma preservação ótima da matriz. Estes resultados destacam o potencial da geração de ECM descelularizada (dECM) através de abordagens assistidas por scCO₂ como uma estratégia promissora para aplicações avançadas em regeneração meniscal.
O desenvolvimento de scaffolds biologicamente funcionais para aplicações meniscais, utilizando a matriz extracelular (ECM) como fonte, tem-se revelado uma alternativa promissora às estratégias de engenharia tecidular. Assim, torna-se necessário desenvolver estratégias de descelularização eficientes que consigam eliminar de forma eficaz os materiais celulares e genéticos, minimizando as respostas imunogénicas e, ao mesmo tempo, preservar ao máximo a ECM, de modo a apoiar as atividades celulares subsequentes essenciais para a regeneração tecidular. Os métodos convencionais de descelularização baseiam-se geralmente na utilização de agentes químicos agressivos, associados à degradação da ECM, à presença de resíduos citotóxicos e a tempos de processamento prolongados, comprometendo a integridade e biocompatibilidade do tecido. Estas limitações têm impulsionado a exploração do dióxido de carbono supercrítico (scCO₂)4uma tecnologia verde e minimamente invasiva4como agente alternativo de descelularização, visando o desenvolvimento de abordagens mais rápidas, económicas e sustentáveis do ponto de vista ambiental. Neste estudo, foi avaliada uma série de protocolos de descelularização assistidos por scCO₂, nos quais foram testados parâmetros operacionais, incluindo o número de ciclos, a velocidade de despressurização, as pressões aplicadas, o tempo de exposição, a utilização de co-solventes, bem como estratégias de lavagem com diferentes solventes, modos de lavagem e intervenções físicas. A eficiência de descelularização foi avaliada através da quantificação de DNA de dupla hélice (dsDNA) residual. A preservação da ECM foi analisada por meio de ensaios bioquímicos para quantificação de glicosaminoglicanos (GAGs), colagénio solúvel e colagénio insolúvel, em paralelo com espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier com reflectância total atenuada (FTIR-ATR) e respetiva análise quimiométrica. Estas avaliações foram também realizadas após esterilização com scCO₂ e o aditivo NovaKillTM, uma mistura composta por ácido peracético (PAA) e peróxido de hidrogénio (H₂O₂). O protocolo assistido por scCO₂4 envolvendo nove ciclos a 160 bar e integrando ciclos de congelação-descongelação, sonicação direta com processador ultrassónico e liofilização4demonstrou a maior eficiência de descelularização, com um conteúdo residual de dsDNA de 88,74 ± 10,25 ng/mg de amostra seca. Adicionalmente, os resultados dos ensaios bioquímicos demonstraram uma preservação significativa da ECM, com apenas degradações mínimas sugeridas pela análise espectroscópica. Após esterilização, não foram observadas diferenças significativas nos resultados da quantificação da ECM nem na análise espectral por FTIR, indicando uma preservação ótima da matriz. Estes resultados destacam o potencial da geração de ECM descelularizada (dECM) através de abordagens assistidas por scCO₂ como uma estratégia promissora para aplicações avançadas em regeneração meniscal.
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Palavras-chave
Orthopedic application Meniscus regeneration Porcine meniscus decellularization Supercritical carbon dioxide Extracellular matrix preservation Aplicação ortopédica Regeneração meniscal Descelularização de menisco porcino Dióxido de carbono supercrítico Preservação da matriz extracelular
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