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Abstract(s)
“Flavescence dorée” (FD) is a grapevine quarantine disease associated with phytoplasmas and transmitted to healthy plants by insect vectors, mainly Scaphoideus titanus Ball. In Europe, FD was firstly reported in 1955, in France, and has dispersed through the central and southern European winegrowing regions, with a great impact in grapevine production. In Portugal, FD was identified for the first time in the “Vinhos Verdes” region (VVR) in 2006. Infected plants usually develop symptoms characterized by stunted growth, unriped cane wood, leaf rolling, yellowing or reddening (depending on berry colour), and shrivelled berries. Conventional management strategies rely mainly on the insecticide treatments, roguing infected plants and use of phytoplasma-free propagation material. However, these strategies are costly and could have undesirable environmental impacts. Development of sustainable approaches for FD control has been hampered by the lack of knowledge about phytoplasma biological properties and plant-pathogen interactions.
The main aim of this thesis was to study the use of elicitors – methyl jasmonate, MeJA, salicylic acid, SA and benzothiadiazole, BTH – against phytoplasma-associated disease in grapevine. Elicitors have been successfully applied as preventive and environmentally friendly treatments for several diseases, but there is limited information on their effect on phytoplasmas. Since phytoplasmas are difficult to cultivate, Catharanthus roseus (commonly known as periwinkle) was used as a model system to study phytoplasma: host interactions as this plant species could present different degrees of symptom’ severity according with the phytoplasma strain. The specific goals of the present study were: (i) characterise FD phytoplasma strain in Vitis vinifera cv. Loureiro and study its effects on grapevine ultrastructure, growth, development, and productivity; (ii) understand the physiological and molecular responses triggered by the MeJA and SA application in FD-infected grapevines under field conditions;
(iii) study the basal genomic and metabolomic profile of healthy and “aster yellows” phytoplasma-infected periwinkles and (iv) understand the role of MeJA and BTH in the induction of defence mechanisms against phytoplasmas.
Field trials revealed that the phytoplasmas infecting grapevine cv. Loureiro belong to the 16SrV-D subgroup and show very low RFLP variability in the tuf and secY genes. Moreover, a two-year study demonstrated that FD infection delays grapevine development, leading to drastic production losses (up to 51%) and a decrease in berry quality, which may be partly linked to ultrastructural modifications, such as collapsed cells in the phloem cell, cell wall thickening and callose deposition, observed in the cells of infected plants. To understand grapevine responses to elicitors’ application – MeJA e SA – plant growth, productivity and berry quality parameters, and the expression of defence related genes were evaluated comparing healthy and FD infected plants treated with MeJA and SA. The application of 25 mM SA at flowering stage showed a partial reduction of the FD symptoms, since at veraison these plants did not show significant differences when compared to healthy plants for those parameters.
However, this elicitor did not show significant effects in enhancing the productivity parameters. On the other hand, MeJA application in two subsequent years showed that the timing of application as well as the elicitor concentration are crucial to the possible management of this disease. In fact, 12.5 mM MeJA seemed to reduce the symptomatology in FD-infected grapevines, especially with the improvement of grapevine yield, also demonstrating a tendency to improve plant growth, development, and productivity parameters. On the other hand, 25 mM MeJA triggered an upregulation of Thau I, Thau II, Osm and PAL (in 2015) and Protα5s, CHIT4c, PIN, PGIP and GLU (in 2016) genes. MeJA treatments also significantly increased saponin and proline synthesis in FD-infected plants.
To assess the impact of phytoplasmas on plant metabolism, three clones of micropropagated periwinkles were used: healthy and aster yellows infected shoots, showing mild (strain AY107) and severe (strain Hyd8) symptomatology degrees, respectively. In those trials it was possible to analyse the metabolomic profile of phytoplasma-infected periwinkles and the induction of defence mechanisms against these pathogens after the elicitation with MeJA and BTH. To that end samples were collected 1 and 4 days after elicitation (dae) treated with 12.5 or 25 mM MeJA and 3.5 or 7 mM BTH. The concentrations of 25 mM MeJA and 3.5 mM BTH showed the lowest malondialdehyde production four dae in infected shoots and an increase by 29% in flavonoid content in AY107 infected shoots one dae. This study also revealed that untreatedinfected shoots of AY107 strain presented higher content of ABA, which could be an indication of active phytoplasma infection as well as both elicitors reduced the phytoplasma symptomatology decreasing the ABA content. In the Hyd8 infected shoots 7 mM BTH and 12.5 mM MeJA resulted the most efficient at 1 and 4 dae, respectively, at biochemistry and molecular levels.
Finally, a basal metabolomic analysis of the aforementioned periwinkle strain shoots identified 13 alkaloids and 11 phenolic compounds and showed the expression of genes related to alkaloid (AS, STR and PRX) and phenylpropanoid (PAL and CHS) biosynthesis pathways. Upregulation of pal, chs, as and str genes only in plants infected by both “aster yellows” strains suggested that the phytoplasma infection influences both alkaloid and phenolic biosynthetic pathways at a metabolic and molecular levels.
Overall, the present PhD thesis put lights on the role of the studied elicitors as a novel and promising approach to manage phytoplasma diseases, developing and implementing new green practices towards a more sustainable and/or organic viticulture.
A flavescência dourada (FD) é uma doença de quarentena da videira causada por fitoplasmas e transmitida a plantas saudáveis por insetos vetor, principalmente o Scaphoideus titanus Ball. Na Europa, a FD foi reportada pela primeira vez em 1955, em França, dispersando-se pelas regiões vitivinícolas do centro e sul da Europa, com grande impacto na produção vitivinícola. Em Portugal, a FD foi identificada pela primeira vez, em 2006, na região dos "Vinhos Verdes" (RVV). As plantas infetadas desenvolvem geralmente sintomas caraterizados por um atraso no crescimento, mau atempamento e murchidão das varas, enrolamento foliar, amarelamento ou avermelhamento (dependendo da variedade) e murchidão dos cachos. As estratégias convencionais de gestão desta doença baseiam-se principalmente em tratamentos com inseticidas, no arranque das plantas infetadas e na produção de material de propagação saudável, livre de fitoplasmas. No entanto, estas estratégias são dispendiosas e podem ter impactos ambientais indesejáveis. O desenvolvimento de abordagens inovadoras e sustentáveis para o controlo da FD tem sido dificultado devido à falta de conhecimento sobre a biologia dos fitoplasmas bem como as interações planta-patógeno. O objetivo principal desta tese foi estudar a utilização de elicitadores – metil jasmonato, MeJA, ácido salicílico, SA e benzotiadiazol, BTH – na luta contra as doenças provocadas por fitoplasmas na videira. Os elicitadores têm sido aplicados com sucesso como tratamentos preventivos e amigos do ambiente em várias doenças, mas a informação existente sobre o seu efeito em doenças provocadas por fitoplasmas é ainda limitada. Uma vez que os fitoplasmas são difíceis de cultivar, o Catharanthus roseus (vulgarmente conhecido como pervinca) foi utilizado no presente trabalho como um sistema modelo para estudar as interações fitoplasma:hospedeiro, uma vez que esta espécie coexiste com estes microrganismos de diferentes níveis de severidade dos sintomas de acordo com a estirpe de fitoplasma. Os objetivos específicos do presente estudo foram: i) caraterizar a estirpe de fitoplasma da FD presente em Vitis vinifera cv. Loureiro e o impacto no crescimento, desenvolvimento, produtividade e ultraestrutura celular da videira; (ii) compreender as respostas fisiológicas e moleculares desencadeadas pela aplicação de MeJA e SA em videiras infetadas com FD em condições de campo; (iii) estudar o perfil genómico e metabólico basal de C. roseus saudáveis e infetados com fitoplasmas “aster yellows” e (iv) compreender o papel do MeJA na indução dos mecanismos de defesa contra os fitoplasmas. Os ensaios de campo revelaram que o fitoplasma presente nas videiras da casta Loureiro pertence ao subgrupo 16SrV-D, apresentando uma variabilidade no padrão de RFLP muito baixa nos genes tuf e secY. Mais ainda, um estudo de dois anos demonstrou que a infeção por FD atrasa o desenvolvimento da videira, levando a perdas drásticas de produção (até 51%) bem como a uma diminuição da qualidade das uvas, que pode estar parcialmente ligada às modificações ultraestruturais, tais como colapso de células e de vacúolos em células do floema, espessamento da parede celular e deposição de calose, observadas nas células das plantas infetadas. Para compreender as respostas da videira à aplicação de elicitadores – MeJA e SA – foram avaliados parâmetros de crescimento, produtividade das plantas, parâmetros de qualidade das uvas, assim como a expressão de genes relacionados com a defesa, comparando plantas saudáveis e infetadas com FD. A aplicação de 25 mM de SA na fase de floração mostrou uma redução parcial dos sintomas de FD, uma vez que, na fase do pintor, estas plantas não mostraram diferenças significativas quando comparadas com plantas saudáveis. No entanto, este elicitador não mostrou efeitos significativos sobre os parâmetros de produtividade. Por outro lado, a aplicação MeJA em dois anos subsequentes mostrou que o momento da aplicação, bem como a concentração de elicitador, são cruciais para o combate a esta doença. De facto, 12,5 mM de MeJA pareceu aliviar os sintomas da FD, demonstrando uma tendência para melhorar os parâmetros de crescimento, desenvolvimento e produtividade das plantas. Por outro lado, o tratamento com 25 mM de MeJA desencadeou um aumento da expressão dos genes Thau I, Thau II, Osm e PAL (em 2015) e Protα5s, CHIT4c, PIN, PGIP e GLU (em 2016). Os tratamentos com MeJA também aumentaram significativamente a síntese de saponinas e prolina em plantas infetadas com FD. Por forma a avaliar impacto dos fitoplasmas no metabolismo das plantas, foram utilizadas três populações de C. roseus micropropagados: uma população de plantas saudáveis e 2 populações de plantas infetadas com “aster yellows”, apresentando níveis de sintomatologia médio (estirpe AY107) e severo (estirpe Hyd8). Nesses trabalhos foi possível analisar pela primeira vez o perfil metabólico de C. roseus infetados com fitoplasmas e a indução dos mecanismos de defesa contra estes agentes patogénicos após a elicitação com MeJA e BTH. Para esse fim foram colhidas amostras 1 e 4 dias após a elicitação (dae) em plantas tratadas com 12,5 ou 25 mM de MeJA e com 3,5 ou 7 mM de BTH. As concentrações de 25 mM de MeJA e 3,5 mM de BTH mostraram a menor produção de malondialdeído 4 dae em plantas infetadas assim como um aumento do teor de flavonóides em 29% em plantas AY107, 1 dae. Este estudo revelou também que plantas não tratadas, da estirpe AY107, apresentavam maior concentração de ABA, o que poderá ser uma indicação da infeção ativa por fitoplasmas, assim como ambos os elicitadores reduziram a sintomatologia provocada pelos fitoplasmas, diminuindo a concentração de ABA. Nas plantas da estirpe Hyd8, 7 mM de BTH e 12,5 mM de MeJA mostraram ser os compostos mais eficazes 1 e 4 dae, respetivamente, a nível bioquímico e molecular. Por fim, através da análise metabólica basal das estirpes de C. roseus supramencionadas foi possível identificar 13 alcalóides e 11 compostos fenólicos, bem como a expressão dos genes relacionados com as vias biossintéticas dos alcalóides (as, str e prx) e dos fenilpropanóides (pal e chs). O aumento da expressão dos genes pal, chs, as e str apenas nas populações de plantas infetadas por “aster yellows” sugere que a infeção afeta tanto as vias biossintéticas dos alcalóides como dos fenilpropanóides, tanto a nível metabólico como molecular. No geral, a presente tese de doutoramento apresenta os elicitadores como uma abordagem inovadora e promissora no combate a doenças causadas por fitoplasmas, desenvolvendo e implementando novas práticas verdes rumo a uma viticultura mais sustentável e/ou biológica.
A flavescência dourada (FD) é uma doença de quarentena da videira causada por fitoplasmas e transmitida a plantas saudáveis por insetos vetor, principalmente o Scaphoideus titanus Ball. Na Europa, a FD foi reportada pela primeira vez em 1955, em França, dispersando-se pelas regiões vitivinícolas do centro e sul da Europa, com grande impacto na produção vitivinícola. Em Portugal, a FD foi identificada pela primeira vez, em 2006, na região dos "Vinhos Verdes" (RVV). As plantas infetadas desenvolvem geralmente sintomas caraterizados por um atraso no crescimento, mau atempamento e murchidão das varas, enrolamento foliar, amarelamento ou avermelhamento (dependendo da variedade) e murchidão dos cachos. As estratégias convencionais de gestão desta doença baseiam-se principalmente em tratamentos com inseticidas, no arranque das plantas infetadas e na produção de material de propagação saudável, livre de fitoplasmas. No entanto, estas estratégias são dispendiosas e podem ter impactos ambientais indesejáveis. O desenvolvimento de abordagens inovadoras e sustentáveis para o controlo da FD tem sido dificultado devido à falta de conhecimento sobre a biologia dos fitoplasmas bem como as interações planta-patógeno. O objetivo principal desta tese foi estudar a utilização de elicitadores – metil jasmonato, MeJA, ácido salicílico, SA e benzotiadiazol, BTH – na luta contra as doenças provocadas por fitoplasmas na videira. Os elicitadores têm sido aplicados com sucesso como tratamentos preventivos e amigos do ambiente em várias doenças, mas a informação existente sobre o seu efeito em doenças provocadas por fitoplasmas é ainda limitada. Uma vez que os fitoplasmas são difíceis de cultivar, o Catharanthus roseus (vulgarmente conhecido como pervinca) foi utilizado no presente trabalho como um sistema modelo para estudar as interações fitoplasma:hospedeiro, uma vez que esta espécie coexiste com estes microrganismos de diferentes níveis de severidade dos sintomas de acordo com a estirpe de fitoplasma. Os objetivos específicos do presente estudo foram: i) caraterizar a estirpe de fitoplasma da FD presente em Vitis vinifera cv. Loureiro e o impacto no crescimento, desenvolvimento, produtividade e ultraestrutura celular da videira; (ii) compreender as respostas fisiológicas e moleculares desencadeadas pela aplicação de MeJA e SA em videiras infetadas com FD em condições de campo; (iii) estudar o perfil genómico e metabólico basal de C. roseus saudáveis e infetados com fitoplasmas “aster yellows” e (iv) compreender o papel do MeJA na indução dos mecanismos de defesa contra os fitoplasmas. Os ensaios de campo revelaram que o fitoplasma presente nas videiras da casta Loureiro pertence ao subgrupo 16SrV-D, apresentando uma variabilidade no padrão de RFLP muito baixa nos genes tuf e secY. Mais ainda, um estudo de dois anos demonstrou que a infeção por FD atrasa o desenvolvimento da videira, levando a perdas drásticas de produção (até 51%) bem como a uma diminuição da qualidade das uvas, que pode estar parcialmente ligada às modificações ultraestruturais, tais como colapso de células e de vacúolos em células do floema, espessamento da parede celular e deposição de calose, observadas nas células das plantas infetadas. Para compreender as respostas da videira à aplicação de elicitadores – MeJA e SA – foram avaliados parâmetros de crescimento, produtividade das plantas, parâmetros de qualidade das uvas, assim como a expressão de genes relacionados com a defesa, comparando plantas saudáveis e infetadas com FD. A aplicação de 25 mM de SA na fase de floração mostrou uma redução parcial dos sintomas de FD, uma vez que, na fase do pintor, estas plantas não mostraram diferenças significativas quando comparadas com plantas saudáveis. No entanto, este elicitador não mostrou efeitos significativos sobre os parâmetros de produtividade. Por outro lado, a aplicação MeJA em dois anos subsequentes mostrou que o momento da aplicação, bem como a concentração de elicitador, são cruciais para o combate a esta doença. De facto, 12,5 mM de MeJA pareceu aliviar os sintomas da FD, demonstrando uma tendência para melhorar os parâmetros de crescimento, desenvolvimento e produtividade das plantas. Por outro lado, o tratamento com 25 mM de MeJA desencadeou um aumento da expressão dos genes Thau I, Thau II, Osm e PAL (em 2015) e Protα5s, CHIT4c, PIN, PGIP e GLU (em 2016). Os tratamentos com MeJA também aumentaram significativamente a síntese de saponinas e prolina em plantas infetadas com FD. Por forma a avaliar impacto dos fitoplasmas no metabolismo das plantas, foram utilizadas três populações de C. roseus micropropagados: uma população de plantas saudáveis e 2 populações de plantas infetadas com “aster yellows”, apresentando níveis de sintomatologia médio (estirpe AY107) e severo (estirpe Hyd8). Nesses trabalhos foi possível analisar pela primeira vez o perfil metabólico de C. roseus infetados com fitoplasmas e a indução dos mecanismos de defesa contra estes agentes patogénicos após a elicitação com MeJA e BTH. Para esse fim foram colhidas amostras 1 e 4 dias após a elicitação (dae) em plantas tratadas com 12,5 ou 25 mM de MeJA e com 3,5 ou 7 mM de BTH. As concentrações de 25 mM de MeJA e 3,5 mM de BTH mostraram a menor produção de malondialdeído 4 dae em plantas infetadas assim como um aumento do teor de flavonóides em 29% em plantas AY107, 1 dae. Este estudo revelou também que plantas não tratadas, da estirpe AY107, apresentavam maior concentração de ABA, o que poderá ser uma indicação da infeção ativa por fitoplasmas, assim como ambos os elicitadores reduziram a sintomatologia provocada pelos fitoplasmas, diminuindo a concentração de ABA. Nas plantas da estirpe Hyd8, 7 mM de BTH e 12,5 mM de MeJA mostraram ser os compostos mais eficazes 1 e 4 dae, respetivamente, a nível bioquímico e molecular. Por fim, através da análise metabólica basal das estirpes de C. roseus supramencionadas foi possível identificar 13 alcalóides e 11 compostos fenólicos, bem como a expressão dos genes relacionados com as vias biossintéticas dos alcalóides (as, str e prx) e dos fenilpropanóides (pal e chs). O aumento da expressão dos genes pal, chs, as e str apenas nas populações de plantas infetadas por “aster yellows” sugere que a infeção afeta tanto as vias biossintéticas dos alcalóides como dos fenilpropanóides, tanto a nível metabólico como molecular. No geral, a presente tese de doutoramento apresenta os elicitadores como uma abordagem inovadora e promissora no combate a doenças causadas por fitoplasmas, desenvolvendo e implementando novas práticas verdes rumo a uma viticultura mais sustentável e/ou biológica.
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Keywords
Elicitors Plant growth and productivity Gene expression Metabolomics Vitis vinifera Crescimento e produtividade vegetal Elicitadores Expressão de genes Metabolómica