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Authors
Abstract(s)
Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen that causes listeriosis in humans. This pathogen mainly affects specific vulnerable groups such as the elderly, newborns, pregnant women, and immunocompromised individuals. The severity of the illness varies based on both intrinsic factors of the affected individuals and the pathogen itself. Therefore, different clinical outcomes can be expected, ranging from simple gastroenteritis to central nervous system, maternal-neonatal, and bacteremia infections. Furthermore, L. monocytogenes is genetically and phenotypically diverse species, resulting in a high variation in stress response and virulence potential among strains. Multilocus sequence typing (MLST) has been widely adopted as a reference method to categorize the clonal structure of bacterial species and to define clonal complexes (CCs) of genetically related isolates, i.e., derived from the same ancestor. In L. monocytogenes, the combination of MLST and epidemiological data allows to distinguish hypervirulent CCs, which are notably more prevalent in clinical cases and typically associated with severe forms of the disease. Contrarily, other CCs, denominated hypovirulent are predominantly isolated from food and food processing environments, and they are linked with the occurrence of listeriosis in highly immunosuppressed individuals. The aim of the present work was to assess and compare the virulence potential of L. monocytogenes strains belonging to both hypervirulent (CC1, CC2, CC4, CC6, CC87 and CC388) and hypovirulent CCs (CC9 and CC121). Sixteen isolates collected from clinical cases occurred in Portugal, distributed among eight distinct CCs, were selected and characterized in terms of: i) in vitro invasion efficiency in Caco-2 cells; ii) presence of premature stop codon (PMSC) mutations in the inlA gene; iii) in vivo infection in Galleria mellonella larvae and health index score characterization, iv) hemolytic activity; and v) ability to survive to the acid barrier of the stomach (pH 2.5 and 3). Five strains were further characterized in terms of immunomodulatory effect in infected G. mellonella larvae and expression of five virulence genes (inlA, inlB, actA, hly, plcA, and prfA). The results obtained demonstrated that there is a clear-cut distinction in the invasion efficiencies in Caco-2 between strains belonging to hyper- and hypovirulent CCs, with CC121 and CC9 isolates showing impaired invasion ability and PMSCs in inlA. Although this CC-related evidence was found in in vitro assays, isolates from CC9 showed an augmented virulent phenotype upon infection of G. mellonella larvae, while some isolates from hypervirulent CCs (CC2 and CC6) yielded reduced larvae mortality rates. Additionally, intra-clonal complex differences were observed among CC6 strains. Comparison of haemolytic activity among CCs, performed using classical blood agar plates and a microplate assay, showed that a CC121 strain presented higher ability to lyse red blood cells. This observation was validated by higher expression levels of hly (the gene encoding the protein listeriolysin O, LLO); this strain also exhibited increased expression of the virulence genes inlA and actA. No significant differences were found between the CCs concerning survival at low pH. In conclusion, the present study emphasizes the importance of incorporating both genotypic and phenotypic data when characterizing the virulence potential of L. monocytogenes. However, further research, such as genome analysis, may shed some light and explain some of the reported phenotypes. Moreover, as the zero-risk infection with L. monocytogenes is still not yet achievable, reliable biomarkers for risk assessment in the food industry need to be identified.
Listeria monocytogenes é um agente patogénico de origem alimentar que causa listeriose humana. Este agente patogénico afeta principalmente idosos, recém-nascidos, grávidas e indivíduos imunocomprometidos, com diferentes graus de gravidade, dependendo de fatores intrínsecos dos indivíduos e do próprio agente patogénico. Por conseguinte, são esperados diferentes quadros clínicos, desde uma simples gastroenterite a infeções do sistema nervoso central, materno-neonatais e bacteriémicas. Além disso, L. monocytogenes é uma espécie diversa, tanto do ponto de vista genético como fenotípico, o que resulta numa elevada variação da resposta ao stress e do potencial de virulência entre estirpes. O Multilocus sequence typing (MLST) tem sido amplamente usado como método de referência para categorizar a estrutura clonal das espécies bacterianas e definir complexos clonais (CCs) de isolados geneticamente relacionados, ou seja, descendentes de um mesmo antepassado. Nesta espécie, a combinação de MLST com dados epidemiológicos permitiu distinguir CCs hipervirulentos que são notavelmente mais prevalentes em casos clínicos e associados a casos graves de listeriose. Contrariamente, outros CCs, denominados hipovirulentos, são predominantemente isolados de alimentos e de ambientes de processamento alimentar e associados à ocorrência de listeriose em indivíduos altamente imunocomprometidos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar e comparar o potencial de virulência de estirpes de L. monocytogenes pertencentes a CCs hiper- (CC1, CC2, CC4, CC6, CC87 e CC388) e hipovirulentos (CC9 e CC12). Dezasseis isolados recolhidos de casos clínicos ocorridos em Portugal, distribuídas por oito CCs distintos, foram selecionados e caracterizados em termos de: i) eficiência de invasão in vitro em células Caco-2; ii) presença de mutações no códão stop-prematuro (PMSC) no gene inlA; iii) infeção in vivo em larvas de Galleria mellonella e caraterização do seu índice saúde, iv) atividade hemolítica; e, v) sobrevivência à barreira ácida do estômago (pH 2,5 e 3). Foram ainda caracterizadas cinco estirpes em termos do seu efeito imunomodulador em larvas de G. mellonella infetadas e a nível da expressão de cinco genes de virulência (inlA, inlB, actA, hly, plcA e prfA). Os resultados obtidos demonstraram que existe uma distinção clara nas eficiências de invasão em células Caco-2 entre estirpes pertencentes a CCs hiper e hipovirulentos, com os isolados do CC121 e CC9 a apresentarem uma baixa capacidade de invasão e PMSCs no gene inlA. Embora esta evidência relacionada com o CC tenha sido encontrada em ensaios in vitro, os isolados do CC9 apresentaram um fenótipo hipervirulento após a infeção de larvas de G. mellonella, enquanto os isolados de CCs hipervirulentos (CC2 e CC6) causaram taxas de mortalidade das larvas reduzidas. Além disso, observaram-se diferenças intra-complexo clonal entre as estirpes do CC6. A comparação da atividade hemolítica entre CCs, realizada utilizando placas de ágar-sangue e um ensaio em microplacas, mostrou que uma estirpe do CC121 apresentava uma maior capacidade de hemólise de glóbulos vermelhos. Esta observação foi validada por níveis de expressão mais elevados do gene hly (que codifica a proteína listeriolisina O, LLO); esta estirpe também apresentou uma expressão aumentada dos genes de virulência inlA e actA. Não foram encontradas diferenças significativas na sobrevivência a pH baixo entre CCs. Em conclusão, o presente estudo sublinhou a importância de incorporar dados genotípicos e fenotípicos na caraterização do potencial de virulência de L. monocytogenes. No entanto, são necessários mais estudos, por exemplo na análise do genoma, para gerar novos conhecimentos e explicar alguns dos fenótipos registados. Além disso, não existindo risco zero de infeção por L. monocytogenes, é necessário identificar biomarcadores fiáveis a utilizar na avaliação de risco na indústria alimentar.
Listeria monocytogenes é um agente patogénico de origem alimentar que causa listeriose humana. Este agente patogénico afeta principalmente idosos, recém-nascidos, grávidas e indivíduos imunocomprometidos, com diferentes graus de gravidade, dependendo de fatores intrínsecos dos indivíduos e do próprio agente patogénico. Por conseguinte, são esperados diferentes quadros clínicos, desde uma simples gastroenterite a infeções do sistema nervoso central, materno-neonatais e bacteriémicas. Além disso, L. monocytogenes é uma espécie diversa, tanto do ponto de vista genético como fenotípico, o que resulta numa elevada variação da resposta ao stress e do potencial de virulência entre estirpes. O Multilocus sequence typing (MLST) tem sido amplamente usado como método de referência para categorizar a estrutura clonal das espécies bacterianas e definir complexos clonais (CCs) de isolados geneticamente relacionados, ou seja, descendentes de um mesmo antepassado. Nesta espécie, a combinação de MLST com dados epidemiológicos permitiu distinguir CCs hipervirulentos que são notavelmente mais prevalentes em casos clínicos e associados a casos graves de listeriose. Contrariamente, outros CCs, denominados hipovirulentos, são predominantemente isolados de alimentos e de ambientes de processamento alimentar e associados à ocorrência de listeriose em indivíduos altamente imunocomprometidos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar e comparar o potencial de virulência de estirpes de L. monocytogenes pertencentes a CCs hiper- (CC1, CC2, CC4, CC6, CC87 e CC388) e hipovirulentos (CC9 e CC12). Dezasseis isolados recolhidos de casos clínicos ocorridos em Portugal, distribuídas por oito CCs distintos, foram selecionados e caracterizados em termos de: i) eficiência de invasão in vitro em células Caco-2; ii) presença de mutações no códão stop-prematuro (PMSC) no gene inlA; iii) infeção in vivo em larvas de Galleria mellonella e caraterização do seu índice saúde, iv) atividade hemolítica; e, v) sobrevivência à barreira ácida do estômago (pH 2,5 e 3). Foram ainda caracterizadas cinco estirpes em termos do seu efeito imunomodulador em larvas de G. mellonella infetadas e a nível da expressão de cinco genes de virulência (inlA, inlB, actA, hly, plcA e prfA). Os resultados obtidos demonstraram que existe uma distinção clara nas eficiências de invasão em células Caco-2 entre estirpes pertencentes a CCs hiper e hipovirulentos, com os isolados do CC121 e CC9 a apresentarem uma baixa capacidade de invasão e PMSCs no gene inlA. Embora esta evidência relacionada com o CC tenha sido encontrada em ensaios in vitro, os isolados do CC9 apresentaram um fenótipo hipervirulento após a infeção de larvas de G. mellonella, enquanto os isolados de CCs hipervirulentos (CC2 e CC6) causaram taxas de mortalidade das larvas reduzidas. Além disso, observaram-se diferenças intra-complexo clonal entre as estirpes do CC6. A comparação da atividade hemolítica entre CCs, realizada utilizando placas de ágar-sangue e um ensaio em microplacas, mostrou que uma estirpe do CC121 apresentava uma maior capacidade de hemólise de glóbulos vermelhos. Esta observação foi validada por níveis de expressão mais elevados do gene hly (que codifica a proteína listeriolisina O, LLO); esta estirpe também apresentou uma expressão aumentada dos genes de virulência inlA e actA. Não foram encontradas diferenças significativas na sobrevivência a pH baixo entre CCs. Em conclusão, o presente estudo sublinhou a importância de incorporar dados genotípicos e fenotípicos na caraterização do potencial de virulência de L. monocytogenes. No entanto, são necessários mais estudos, por exemplo na análise do genoma, para gerar novos conhecimentos e explicar alguns dos fenótipos registados. Além disso, não existindo risco zero de infeção por L. monocytogenes, é necessário identificar biomarcadores fiáveis a utilizar na avaliação de risco na indústria alimentar.
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Keywords
Listeria monocytogenes Virulence Gene expression Clonal complexes Infection Virulência Expressão genética Complexos clonais Infeção