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Abstract(s)
The use of fluoroquinolone antibiotics for therapeutic, prophylactic and growth promotion applications is increasing worldwide. Due to its halogenated characteristics, ecotoxicity and persistence, a special importance is given to their occurrence in the environment. Since some fluoroquinolones have one or more stereogenic centers, they give rise to pairs of enantiomers. The pharmacological properties and toxicity of enantiomers can be very different. The stereochemistry of these compounds represents a major challenge in terms of its environmental monitoring and is frequently ignored. The presence of fluoroquinolones has been described in many environmental matrices, but few studies were done in Portugal regarding environmental monitoring studies. Degradative processes for the removal of fluoroquinolones have also been subject of several studies, but none has considered the relevance of the stereochemistry. The work described in this thesis comprises the development of new analytical methods using liquid chromatography with fluorescence detection (LC-FD) to assess biodegradation of chiral and achiral fluoroquinolone antibiotics and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) to quantify fluoroquinolones residues in different environmental matrices, such as influents and effluents of waste water treatment plants. As the metabolites/degradation products originated during degradation processes may present higher ecotoxicity than the parent compound this work also aimed to identify the most important by-products originated during these processes. Fluoroquinolones by-products formed during degradation assays were identified using an integrated analytical approach and these studies enabled the proposal of the chemical structures of two new metabolites for ofloxacin and norfloxacin, never reported before. Biodegradation of chiral fluoroquinolone antibiotics in laboratory experiments using activated sludge and two single bacterial strains were followed by the enantioselective methods developed. An analytical method for quantification and achiral assessment of fluoroquinolones in environmental matrices was developed and applied to wastewater treatment plants influents and effluents.
A ristocetin A-based chiral stationary phase (Chirobiotic™ R column) was used for the development of an enantioselective method by Liquid Chromatography with Fluorescence Detection, which after validation allowed for the analysis of ofloxacin and levofloxacin enantiomers in biodegradation assays performed with activated sludge. Biodegradation of ofloxacin proved to be enantioselective and both fluoroquinolones biodegradation extents were enhanced with supplementation with acetate. Subsequently, mass spectrometric analysis confirmed the racemization of the pure enantiomer levofloxacin during the biodegradation by the activated sludge inoculum. These results were reported for the first time in this work.
Two single bacterial strains (Labrys portucalensis F11 and Rhodococcus sp. FP1) were assessed regarding their enantioselective behavior on the biodegradation of ofloxacin and levofloxacin at a laboratory-scale microcosm, using the previously validated analytical method. Biodegradation studies were conducted under different initial concentrations of the two fluoroquinolones and different supplementations with acetate were tested. Racemic ofloxacin was enantioselectively biodegraded by both bacterial strains, with the S-enantiomer showing preferential removal and consequently enrichment of the R-enantiomer was observed. Both fluoroquinolones were degraded to an almost complete extent by strain F11. Racemization of levofloxacin was observed in its biodegradation by
strain F11 and confirmed using mass spectrometric analysis. This work described enantioselective biodegradation of ofloxacin and levofloxacin by single bacteria for the first time.
A solid phase extraction – liquid chromatography with tandem mass spectrometry method was developed with a triple quadrupole mass analyzer for the quantification of seven fluoroquinolone antibiotics in environmental aqueous matrices. Oasis® HLB columns were used for the clean-up and concentration of 100 mL influent and effluent samples from fifteen wastewater treatment plants. Method detection limits ranged from 6.7 to 59.0 ng L-1. High concentrations of ofloxacin, up to 4587.0 ng L-1, were found in influent samples. Ofloxacin and ciprofloxacin were the fluoroquinolones most frequently detected. Norfloxacin and prulifloxacin were not found in any of the analyzed samples.
O uso de fluoroquinolonas para aplicações terapêuticas, profiláticas e de promoção do crescimento tem aumentado em todo o Mundo. Devido às suas características halogenadas, ecotoxicidade e persistência, uma importância especial é dada à sua ocorrência no meio ambiente. Como algumas fluoroquinolonas possuem um ou mais centros estereogénicos, dão origem a pares de enantiómeros. As propriedades farmacológicas e a toxicidade dos enantiómeros podem ser muito diferentes. A estereoquímica destes compostos representa um grande desafio em termos de monitorização ambiental e é frequentemente ignorada. A presença de fluoroquinolonas foi descrita em muitas matrizes ambientais, mas poucos estudos foram feitos em Portugal sobre estudos de monitorização ambiental. Processos degradativos para a remoção de fluoroquinolonas têm sido alvo de vários estudos, mas nenhum considera a relevância da estereoquímica dos compostos. O trabalho descrito nesta tese compreende o desenvolvimento de novos métodos analíticos usando cromatografia líquida com detecção de fluorescência (LC-FD) para avaliar a biodegradação de fluoroquinolonas quirais e aquirais e espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) para quantificar resíduos de fluoroquinolonas em diferentes matrizes ambientais, como afluentes e efluentes de estações de tratamento de águas residuais. Como os metabolitos / produtos de degradação originados durante os processos de degradação podem apresentar maior ecotoxicidade que o composto-mãe, este trabalho também objetivou identificar os subprodutos mais importantes originados durante esses processos. Subprodutos de fluoroquinolonas formados durante os ensaios de degradação foram identificados usando uma abordagem analítica integrada e esses estudos permitiram a proposta das estruturas químicas de dois novos metabolitos para a ofloxacina e a norfloxacina, nunca relatados anteriormente. A biodegradação de fluoroquinolonas quirais em experiências laboratoriais utilizando lamas ativadas e duas estirpes bacterianas isoladas foi seguida pelos métodos enantiosseletivos desenvolvidos. Um método analítico para a quantificação e a avaliação aquiral de fluoroquinolonas em matrizes ambientais foi desenvolvido e aplicado a afluentes e efluentes de estações de tratamento de águas residuais. Foi utilizada uma fase estacionária quiral baseada em ristocetina A (coluna Chirobiotic® R) para o desenvolvimento de um método enantiosseletivo de LC-FD, que após validação permitiu a análise dos enantiómeros da ofloxacina e levofloxacina em ensaios de biodegradação realizados com lamas ativadas. A biodegradação da ofloxacina provou ser enantiosseletiva e ambas as extensões da biodegradação destas fluoroquinolonas foram aumentadas com suplementação com acetato. Posteriormente, a análise espectrométrica de massa confirmou a racemização do enantiómero puro levofloxacina durante a biodegradação pelo inóculo da lamas ativadas. Estes resultados foram relatados pela primeira vez neste trabalho. Duas estirpes bacterianas (Labrys portucalensis F11 e Rhodococcus sp. FP1) foram avaliadas quanto ao seu comportamento enantiosseletivo na biodegradação de ofloxacina e levofloxacina em microcosmos de escala laboratorial, utilizando o método analítico previamente validado. Os estudos de biodegradação foram conduzidos sob diferentes concentrações iniciais das duas fluoroquinolonas e diferentes suplementações com acetato foram testadas. A ofloxacina racémica foi biodegradada enantiosseletivamente por ambas as estirpes bacterianas, com o enantiómero S mostrando remoção preferencial e consequentemente o enriquecimento do enantiómero R foi observado. Ambas as fluoroquinolonas foram degradadas quase completamente pela estirpe F11. A racemização da levofloxacina foi observada durante a biodegradação pela estirpe F11 e confirmada por análise espectrométrica de massa. Este trabalho descreveu pela primeira vez a biodegradação enantiosseletiva da ofloxacina e da levofloxacina por bactérias isoladas. Foi desenvolvido um método de extração em fase sólida associado a LC-MS/MS com um espectrómetro de massa do tipo triplo quadrupolo para a quantificação de sete fluoroquinolonas em matrizes ambientais aquosas. As colunas Oasis® HLB foram usadas para a limpeza e concentração de 100 mL de amostras de afluentes e efluentes de quinze estações de tratamento de águas residuais. Os limites de detecção do método variaram de 6,7 a 59,0 ng L-1. Altas concentrações de ofloxacina, até 4587,0 ng L-1, foram encontradas em amostras de influentes. Ofloxacina e ciprofloxacina foram as fluoroquinolonas mais frequentemente detectadas. A norfloxacina e a prulifloxacina não foram encontradas em nenhuma das amostras analisadas
O uso de fluoroquinolonas para aplicações terapêuticas, profiláticas e de promoção do crescimento tem aumentado em todo o Mundo. Devido às suas características halogenadas, ecotoxicidade e persistência, uma importância especial é dada à sua ocorrência no meio ambiente. Como algumas fluoroquinolonas possuem um ou mais centros estereogénicos, dão origem a pares de enantiómeros. As propriedades farmacológicas e a toxicidade dos enantiómeros podem ser muito diferentes. A estereoquímica destes compostos representa um grande desafio em termos de monitorização ambiental e é frequentemente ignorada. A presença de fluoroquinolonas foi descrita em muitas matrizes ambientais, mas poucos estudos foram feitos em Portugal sobre estudos de monitorização ambiental. Processos degradativos para a remoção de fluoroquinolonas têm sido alvo de vários estudos, mas nenhum considera a relevância da estereoquímica dos compostos. O trabalho descrito nesta tese compreende o desenvolvimento de novos métodos analíticos usando cromatografia líquida com detecção de fluorescência (LC-FD) para avaliar a biodegradação de fluoroquinolonas quirais e aquirais e espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) para quantificar resíduos de fluoroquinolonas em diferentes matrizes ambientais, como afluentes e efluentes de estações de tratamento de águas residuais. Como os metabolitos / produtos de degradação originados durante os processos de degradação podem apresentar maior ecotoxicidade que o composto-mãe, este trabalho também objetivou identificar os subprodutos mais importantes originados durante esses processos. Subprodutos de fluoroquinolonas formados durante os ensaios de degradação foram identificados usando uma abordagem analítica integrada e esses estudos permitiram a proposta das estruturas químicas de dois novos metabolitos para a ofloxacina e a norfloxacina, nunca relatados anteriormente. A biodegradação de fluoroquinolonas quirais em experiências laboratoriais utilizando lamas ativadas e duas estirpes bacterianas isoladas foi seguida pelos métodos enantiosseletivos desenvolvidos. Um método analítico para a quantificação e a avaliação aquiral de fluoroquinolonas em matrizes ambientais foi desenvolvido e aplicado a afluentes e efluentes de estações de tratamento de águas residuais. Foi utilizada uma fase estacionária quiral baseada em ristocetina A (coluna Chirobiotic® R) para o desenvolvimento de um método enantiosseletivo de LC-FD, que após validação permitiu a análise dos enantiómeros da ofloxacina e levofloxacina em ensaios de biodegradação realizados com lamas ativadas. A biodegradação da ofloxacina provou ser enantiosseletiva e ambas as extensões da biodegradação destas fluoroquinolonas foram aumentadas com suplementação com acetato. Posteriormente, a análise espectrométrica de massa confirmou a racemização do enantiómero puro levofloxacina durante a biodegradação pelo inóculo da lamas ativadas. Estes resultados foram relatados pela primeira vez neste trabalho. Duas estirpes bacterianas (Labrys portucalensis F11 e Rhodococcus sp. FP1) foram avaliadas quanto ao seu comportamento enantiosseletivo na biodegradação de ofloxacina e levofloxacina em microcosmos de escala laboratorial, utilizando o método analítico previamente validado. Os estudos de biodegradação foram conduzidos sob diferentes concentrações iniciais das duas fluoroquinolonas e diferentes suplementações com acetato foram testadas. A ofloxacina racémica foi biodegradada enantiosseletivamente por ambas as estirpes bacterianas, com o enantiómero S mostrando remoção preferencial e consequentemente o enriquecimento do enantiómero R foi observado. Ambas as fluoroquinolonas foram degradadas quase completamente pela estirpe F11. A racemização da levofloxacina foi observada durante a biodegradação pela estirpe F11 e confirmada por análise espectrométrica de massa. Este trabalho descreveu pela primeira vez a biodegradação enantiosseletiva da ofloxacina e da levofloxacina por bactérias isoladas. Foi desenvolvido um método de extração em fase sólida associado a LC-MS/MS com um espectrómetro de massa do tipo triplo quadrupolo para a quantificação de sete fluoroquinolonas em matrizes ambientais aquosas. As colunas Oasis® HLB foram usadas para a limpeza e concentração de 100 mL de amostras de afluentes e efluentes de quinze estações de tratamento de águas residuais. Os limites de detecção do método variaram de 6,7 a 59,0 ng L-1. Altas concentrações de ofloxacina, até 4587,0 ng L-1, foram encontradas em amostras de influentes. Ofloxacina e ciprofloxacina foram as fluoroquinolonas mais frequentemente detectadas. A norfloxacina e a prulifloxacina não foram encontradas em nenhuma das amostras analisadas