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Authors
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Abstract(s)
The skin acts as the organism's first line of defense against physical, chemical, and biological agents. Currently, assessing the skin-sensitizing potential of new chemicals relies upon their application in animal models. However, due to their questionable biological similarity to humans, ethical issues, and current European legislation that requires animal models to be discontinued, new alternatives must be developed. To overcome these constraints, organotypic human skin models are a promising choice however, most of the available models lack an immune system and other native skin characteristics. Thus, the main objective of this thesis is to create and characterize an in vitro immunocompetent skin model comprising fibroblasts, keratinocytes, and Langerhans cells (LGs), capable of mimicking the interactions between different cells and simulating the systemic response of the human body. Furthermore, to overcome the limited number of LGs available, the use of mature dendritic cells was explored for the development of the immunocompetent skin model and their performance compared against LGs. For LGs isolation, magnetic sorting was the chosen method from the applied approaches since it resulted in a purer population of fully functional LGs capable of responding successfully to inflammatory stimuli and enhancing T-cell proliferation. Regarding mDCs, the THP-1 cell line was used to differentiate them. The acquired cells were found to be functional and capable of acting as LGs surrogates, as they respond to allergens and activate T cell proliferation in the same way the epidermal LGs do. Model characterization allowed us to confirm that the ratios of 1 LG to 50 KCs and 1 mDC to 5 KCs in the case of LGs and mDCs, respectively, were the most similar to the in vivo tissue organization and, as a result, had better epidermal stratification and differentiation. The presence of melanocytes in the LGs model was also confirmed, resulting in a more physiologically relevant and accurate representation of human skin. Furthermore, when exposed to a skin sensitizer, NiSO4, the immune cells within the models were able to migrate to the dermis, revealing that the cells were active and functional. In short, the two immunocompetent models established are capable of mimicking human skin organization, simulating crosstalk between different cells, and reproducing one of the key steps of the systemic response of the human body, making them an excellent in vitro research tool for studying the biology and functionality of dendritic cells under controlled conditions. Notwithstanding, these models can also be used to create future platforms for assessing the allergenicity and toxicity of novel chemicals.
A pele atua como a primeira linha de defesa contra os agentes físicos, químicos e biológicos externos a que estamos diariamente expostos. Atualmente, a principal forma de avaliar o potencial sensitizante cutâneo de produtos químicos reside na aplicação em modelos animais. Contudo, face à questionável semelhança biológica destes com o ser humano, bem como às questões éticas e à legislação europeia em vigor que impõe abolir o uso dos modelos animais, torna-se necessário desenvolver novas alternativas. Os modelos organotípicos da pele humana são uma boa opção para eliminar estas limitações, no entanto, a maioria dos modelos disponíveis carece de um sistema imunitário e outras características da pele nativa. Assim, o objetivo principal da presente tese consiste na criação de um modelo in vitro imunocompetente da pele, constituído por fibroblastos, queratinócitos e células de Langerhans, capaz de mimetizar as interações entre as diferentes células e simular a resposta sistémica do corpo humano. Adicionalmente, para superar o número limitado de células de LGs, explorou-se o uso de células dendríticas maduras para o desenvolvimento do modelo e comparou-se o seu desempenho com as LGs. No que concerne ao método de isolamento das LGs, a purificação magnética resultou na obtenção de uma população de células de LGs completamente funcionais e, por sua vez, capazes de responder com sucesso a um estímulo inflamatório e ativar as células T. No que diz respeito às mDC diferenciadas através da linha celular THP-1, verificou-se que estas podem substituir as LGs, uma vez que demonstraram a capacidade de responder a um alergénio e estimular o crescimento das células T da mesma forma que as LGs epidérmicas. Ademais, a caracterização dos modelos permitiu aferir que os mais semelhantes com o tecido in vivo e, consequentemente com uma melhor estratificação e diferenciação epidérmica, são os modelos com rácios de 1 LG para 50 KCs e 1 mDC para 5 KCs no caso das LGs e das mDCs, respetivamente. Além disso, possibilitou confirmar a presença de melanócitos no modelo das LGs, o que torna este modelo significativamente mais semelhante à pele humana. A validação dos modelos, que consistiu na aplicação tópica de NiSO4, demonstrou que as células imunes adquiriram a capacidade de migrar para a derme, o que significa que estas se encontram ativas e funcionais. Em suma, os dois modelos imunocompetentes desenvolvidos são capazes de mimetizar a organização da pele humana e simular o crosstalk entre as diferentes células, bem como reproduzir um dos principais passos da resposta imune, pelo que permitem estudar o comportamento e a funcionalidade das células dendríticas sob um ambiente in vitro controlado. Por conseguinte, estes poderão servir como ponto de partida e fomentar o desenvolvimento de futuras plataformas dirigidas à avaliação de alergénios e toxicidade de novos produtos químicos.
A pele atua como a primeira linha de defesa contra os agentes físicos, químicos e biológicos externos a que estamos diariamente expostos. Atualmente, a principal forma de avaliar o potencial sensitizante cutâneo de produtos químicos reside na aplicação em modelos animais. Contudo, face à questionável semelhança biológica destes com o ser humano, bem como às questões éticas e à legislação europeia em vigor que impõe abolir o uso dos modelos animais, torna-se necessário desenvolver novas alternativas. Os modelos organotípicos da pele humana são uma boa opção para eliminar estas limitações, no entanto, a maioria dos modelos disponíveis carece de um sistema imunitário e outras características da pele nativa. Assim, o objetivo principal da presente tese consiste na criação de um modelo in vitro imunocompetente da pele, constituído por fibroblastos, queratinócitos e células de Langerhans, capaz de mimetizar as interações entre as diferentes células e simular a resposta sistémica do corpo humano. Adicionalmente, para superar o número limitado de células de LGs, explorou-se o uso de células dendríticas maduras para o desenvolvimento do modelo e comparou-se o seu desempenho com as LGs. No que concerne ao método de isolamento das LGs, a purificação magnética resultou na obtenção de uma população de células de LGs completamente funcionais e, por sua vez, capazes de responder com sucesso a um estímulo inflamatório e ativar as células T. No que diz respeito às mDC diferenciadas através da linha celular THP-1, verificou-se que estas podem substituir as LGs, uma vez que demonstraram a capacidade de responder a um alergénio e estimular o crescimento das células T da mesma forma que as LGs epidérmicas. Ademais, a caracterização dos modelos permitiu aferir que os mais semelhantes com o tecido in vivo e, consequentemente com uma melhor estratificação e diferenciação epidérmica, são os modelos com rácios de 1 LG para 50 KCs e 1 mDC para 5 KCs no caso das LGs e das mDCs, respetivamente. Além disso, possibilitou confirmar a presença de melanócitos no modelo das LGs, o que torna este modelo significativamente mais semelhante à pele humana. A validação dos modelos, que consistiu na aplicação tópica de NiSO4, demonstrou que as células imunes adquiriram a capacidade de migrar para a derme, o que significa que estas se encontram ativas e funcionais. Em suma, os dois modelos imunocompetentes desenvolvidos são capazes de mimetizar a organização da pele humana e simular o crosstalk entre as diferentes células, bem como reproduzir um dos principais passos da resposta imune, pelo que permitem estudar o comportamento e a funcionalidade das células dendríticas sob um ambiente in vitro controlado. Por conseguinte, estes poderão servir como ponto de partida e fomentar o desenvolvimento de futuras plataformas dirigidas à avaliação de alergénios e toxicidade de novos produtos químicos.
Description
Keywords
Langerhans cells In vitro immunocompetent skin model Mature dendritic cells THP-1 Skin-sensitizer potential Células de Langerhans Modelo in vitro imunocompetente de pele Células dendríticas maduras Potencial sensibilizador cutâneo