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Potential bacterial carriers of antibiotic resistance in aquaculture and aquaponics
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Aquaculture (aquatic animal farming) and Aquaponics (an integration of aquaculture and soilless plant cultivation) systems are increasingly used to simultaneously produce fish and plants within the same circulating water system. Fish skin mucus is in direct contact with the environment, functioning as a physical, biochemical, and semipermeable barrier for the fish. Moreover, the bacterial communities within fish skin mucus may reflect the bacterial diversity of the surrounding water and consequently of the resistome (group of genes associated to antibiotic resistance). Fish skin mucus is also described as having associated antimicrobial activity. This dissertation aimed to assess whether fish and plants cultivated in aquaculture/aquaponics systems can be colonized by antibiotic resistant bacteria and antibiotic resistance genes, and if fish skin mucus are more prone to accumulate antibiotic resistance than aquaculture biofilms. For that, both culture dependent and culture independent methods were used to study the occurrence of antibiotic resistant bacteria and genes in samples from the fish skin mucus, biofilms of the aquaculture tanks and in plants growing in an experimental aquaponic system. Bacterial growth was assessed on GSP agar (selective for Pseudomonads and Aeromonads) and GSP agar supplemented with cefotaxime (4 mg/L) and streptomycin (50 mg/L). Isolates (n=114) were selected for phenotypic antibiotic resistance profiling and genotypic analysis targeting resistance genes for β-lactams (blaCTX, blaSHV, and blaOXA), and genes associated to mobile genetic elements (intI1 and incF). Bacterial isolates (n=22) harboring the intI1 gene were further analyzed for the presence of class 1 integrons and integron variable regions sequenced. Additionally, qPCR was used for the quantification of the 16S rRNA gene as well as the intI1 integrase gene, a biomarker for antibiotic resistance, in samples of water and lettuce roots from the experimental aquaponics system. The highest bacterial growth occurred on GSP without selective pressure, while the addition of streptomycin to the GSP culture medium resulted in the most inhibitory effect on the growth of bacteria especially in the biofilm and roots samples (<1.4% of tolerant bacteria). Overall, 3.6-38.6% (average values) of the cultivable bacteria growing on GSP tolerated the 4 mg/L of cefotaxime while just 0.2-3.9% (average values) tolerated the 50 mg/L of streptomycin. Most of the bacterial isolates recovered were Gram-negative (111/114), catalase positive and cytochrome c oxidase negative. When observing the antibiograms results, resistance to cephalothin and streptomycin were among the most prevalent (60-98% and 34-70%, respectively) in the isolates of the different origins. In contrast isolates showed a low prevalence of resistance to tetracycline, meropenem, ciprofloxacin or colistin (<15%). Multi drug resistances were mainly observed in isolates recovered from biofilms and roots. Fish skin mucus isolates were identified to be mainly Acinetobacter johnsonii, Achromobacter spp., and Flavobacterium spp. while the isolates recovered from the biofilms present in the same aquaculture system were predominantly identified as E. coli and Achromobacter spp. The main species identified in the lettuce roots were Pseudomonas monteilii and Enterobacter ludwigii. Genes associated with mobile elements intI1 and incF were detected in <20% of isolates mostly E. coli from biofilms. The blaSHV gene was just detected in E. coli isolates from biofilm, for which were also detected the genes intI1 and incF. Class 1 integrons were detected in 18 isolates mostly from biofilms, with one present in a biofilm E. coli isolate, confirmed to carry the aminoglycoside resistance gene aadA1. These results demonstrate that biofilms are a major hotspot for bacteria and genes associated with antibiotic resistance, while fish skin mucus and lettuce roots were not identified as important hotspots.
A aquacultura (criação de animais aquáticos em ambiente controlado) e a aquaponia (integração da aquacultura com o cultivo de plantas sem solo) são sistemas cada vez mais utilizados para produzir simultaneamente peixes e plantas no mesmo sistema de circulação de água. O muco da pele dos peixes está em contacto direto com o ambiente, funcionando como uma barreira física, bioquímica e semipermeável para o peixe. Além disso, as comunidades bacterianas presentes no muco da pele dos peixes podem refletir a diversidade bacteriana da água circundante e, consequentemente, do resistoma (conjunto de genes associados à resistência a antibióticos). O muco da pele dos peixes também é descrito como tendo atividade antimicrobiana associada. Esta dissertação teve como objetivo avaliar se peixes e plantas cultivadas em sistemas de aquacultura/aquaponia podem ser colonizados por bactérias resistentes a antibióticos e genes de resistência a antibióticos, e se o muco da pele dos peixes é mais propenso a acumular resistência a antibióticos do que os biofilmes da aquacultura. Para isso, foram utilizados métodos dependentes e independentes de cultivo para estudar a ocorrência de bactérias e genes de resistência a antibióticos em amostras do muco da pele dos peixes, biofilmes dos tanques de aquacultura e em plantas cultivadas num sistema experimental de aquaponia. O crescimento bacteriano foi avaliado em ágar GSP (seletivo para Pseudomonadas e Aeromonadas) e ágar GSP suplementado com cefotaxima (4 mg/L) e estreptomicina (50 mg/L). Foram selecionados isolados (n=114) para análise fenotípica da resistência a antibióticos e análise genotípica direcionada a genes de resistência a β-lactámicos (blaCTX, blaSHV e blaOXA) e genes associados a elementos genéticos móveis (intI1 e incF). Os isolados bacterianos (n=22) que apresentaram o gene intI1 foram analisados mais profundamente para deteção de integrões de classe 1 e as regiões variáveis dos integrões foram sequenciadas. Adicionalmente, foi utilizado qPCR para quantificação do gene 16S rRNA, bem como do gene da integrase intI1, um biomarcador para resistência a antibióticos, em amostras de água e raízes de alface do sistema experimental de aquaponia. O maior crescimento bacteriano ocorreu no ágar GSP sem pressão seletiva, enquanto a adição de estreptomicina ao meio de cultura GSP resultou no maior efeito inibitório do crescimento bacteriano, especialmente nas amostras de biofilme e raízes (<1,4% de bactérias tolerantes). No geral, entre 3,6% a 38,6% (valores médios) das bactérias cultiváveis que cresceram em GSP toleraram 4 mg/L de cefotaxima, enquanto apenas 0,2% a 3,9% toleraram 50 mg/L de estreptomicina. A maioria dos isolados bacterianos recuperados eram Gram-negativos (111/114), catalase positivos e citocromo c oxidase negativo. Ao observar os resultados dos antibiogramas, a resistência à cefalotina e à estreptomicina esteve entre as mais prevalentes (60-98% e 34-70%, respetivamente) nos isolados de diferentes origens. Em contraste, os isolados mostraram baixa prevalência de resistência à tetraciclina, meropenem, ciprofloxacina ou colistina (<15%). Resistência a múltiplos antibióticos foram principalmente observadas em isolados recuperados de biofilme e raízes. Os isolados do muco da pele dos peixes foram identificados principalmente como Acinetobacter johnsonii, Achromobacter spp. e Flavobacterium spp., enquanto os isolados recuperados dos biofilmes presentes no mesmo sistema de aquacultura foram predominantemente identificados como E. coli e Achromobacter spp. As principais espécies identificadas nas raízes de alface foram Pseudomonas monteilii e Enterobacter ludwigii. Os genes associados a elementos genéticos móveis, intI1 e incF, foram detetados em <20% dos isolados, principalmente E. coli de biofilme. O gene blaSHV foi apenas detetado em isolados de E. coli provenientes de biofilme, nos quais também foram detetados os genes intI1 e incF. Integrões de classe 1 foram detetados em 18 isolados, maioritariamente de biofilmes, com um isolado de E. coli de biofilme confirmado como portador do gene de resistência a aminoglicosídeos aadA1. Estes resultados demonstram que os biofilmes são um dos principais hotspots para bactérias e genes associados à resistência a antibióticos, enquanto o muco da pele dos peixes e as raízes de alface não foram identificados como hotspots relevantes.
A aquacultura (criação de animais aquáticos em ambiente controlado) e a aquaponia (integração da aquacultura com o cultivo de plantas sem solo) são sistemas cada vez mais utilizados para produzir simultaneamente peixes e plantas no mesmo sistema de circulação de água. O muco da pele dos peixes está em contacto direto com o ambiente, funcionando como uma barreira física, bioquímica e semipermeável para o peixe. Além disso, as comunidades bacterianas presentes no muco da pele dos peixes podem refletir a diversidade bacteriana da água circundante e, consequentemente, do resistoma (conjunto de genes associados à resistência a antibióticos). O muco da pele dos peixes também é descrito como tendo atividade antimicrobiana associada. Esta dissertação teve como objetivo avaliar se peixes e plantas cultivadas em sistemas de aquacultura/aquaponia podem ser colonizados por bactérias resistentes a antibióticos e genes de resistência a antibióticos, e se o muco da pele dos peixes é mais propenso a acumular resistência a antibióticos do que os biofilmes da aquacultura. Para isso, foram utilizados métodos dependentes e independentes de cultivo para estudar a ocorrência de bactérias e genes de resistência a antibióticos em amostras do muco da pele dos peixes, biofilmes dos tanques de aquacultura e em plantas cultivadas num sistema experimental de aquaponia. O crescimento bacteriano foi avaliado em ágar GSP (seletivo para Pseudomonadas e Aeromonadas) e ágar GSP suplementado com cefotaxima (4 mg/L) e estreptomicina (50 mg/L). Foram selecionados isolados (n=114) para análise fenotípica da resistência a antibióticos e análise genotípica direcionada a genes de resistência a β-lactámicos (blaCTX, blaSHV e blaOXA) e genes associados a elementos genéticos móveis (intI1 e incF). Os isolados bacterianos (n=22) que apresentaram o gene intI1 foram analisados mais profundamente para deteção de integrões de classe 1 e as regiões variáveis dos integrões foram sequenciadas. Adicionalmente, foi utilizado qPCR para quantificação do gene 16S rRNA, bem como do gene da integrase intI1, um biomarcador para resistência a antibióticos, em amostras de água e raízes de alface do sistema experimental de aquaponia. O maior crescimento bacteriano ocorreu no ágar GSP sem pressão seletiva, enquanto a adição de estreptomicina ao meio de cultura GSP resultou no maior efeito inibitório do crescimento bacteriano, especialmente nas amostras de biofilme e raízes (<1,4% de bactérias tolerantes). No geral, entre 3,6% a 38,6% (valores médios) das bactérias cultiváveis que cresceram em GSP toleraram 4 mg/L de cefotaxima, enquanto apenas 0,2% a 3,9% toleraram 50 mg/L de estreptomicina. A maioria dos isolados bacterianos recuperados eram Gram-negativos (111/114), catalase positivos e citocromo c oxidase negativo. Ao observar os resultados dos antibiogramas, a resistência à cefalotina e à estreptomicina esteve entre as mais prevalentes (60-98% e 34-70%, respetivamente) nos isolados de diferentes origens. Em contraste, os isolados mostraram baixa prevalência de resistência à tetraciclina, meropenem, ciprofloxacina ou colistina (<15%). Resistência a múltiplos antibióticos foram principalmente observadas em isolados recuperados de biofilme e raízes. Os isolados do muco da pele dos peixes foram identificados principalmente como Acinetobacter johnsonii, Achromobacter spp. e Flavobacterium spp., enquanto os isolados recuperados dos biofilmes presentes no mesmo sistema de aquacultura foram predominantemente identificados como E. coli e Achromobacter spp. As principais espécies identificadas nas raízes de alface foram Pseudomonas monteilii e Enterobacter ludwigii. Os genes associados a elementos genéticos móveis, intI1 e incF, foram detetados em <20% dos isolados, principalmente E. coli de biofilme. O gene blaSHV foi apenas detetado em isolados de E. coli provenientes de biofilme, nos quais também foram detetados os genes intI1 e incF. Integrões de classe 1 foram detetados em 18 isolados, maioritariamente de biofilmes, com um isolado de E. coli de biofilme confirmado como portador do gene de resistência a aminoglicosídeos aadA1. Estes resultados demonstram que os biofilmes são um dos principais hotspots para bactérias e genes associados à resistência a antibióticos, enquanto o muco da pele dos peixes e as raízes de alface não foram identificados como hotspots relevantes.
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Antibiotic resistance Aquaculture Aquaponics Fish skin mucus Resistência a antibióticos Aquacultura Aquaponia Muco da pele dos peixes
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