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Publication
Fetalix in vivo validation and process scalability
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Abstract(s)
Low back pain (LBP) is a musculoskeletal condition that affects over 80% of the population. It is mainly caused by degeneration of the intervertebral disc (IVD), a core element for spinal mobility. As current therapies do not provide long-term solutions, there is an urgent need to develop novel treatments to restore a functional tissue. Our group has previously showed that fetal bovine nucleus pulposus (NP), the central part of the IVD, is enriched with collagen XII and XIV, two pro-regenerative proteins that disappear with age. Moreover, fetal decellularized NPs co-cultured with bovine NP cells, expressed higher levels of aggrecan and collagen II and reduced neovessel formation. From this work resulted Fetalix – the first fetal-inspired biomaterial to treat LBP. Thus, the goal of this thesis was to assess Fetalix potential in vivo through magnetic resonance imaging (MRI), histology and behavioural assessment, while optimizing its scalable production and injectability. Modified decellularization protocols enabled 6-8% time reduction and enabled an increase in processing capacity. However, further optimization is required to achieve a double strand DNA reduction of <50ng per mg of extracellular matrix dry weight. As expected, glycosaminoglycans content was reduced. Regarding biomaterial’s production and particle characterization, the 4-Place Mini Bead Mill homogeniser enabled the production of smaller and more porous particles, being selected for Fetalix production. 50 milling cycles were required to achieve an injectable solution. An injectability assay revealed peak and average forces around 200g, indicating easily injectable solutions. The in vivo study revealed that MRI (obtained through a developed algorithm) and histology results were consistent, expect hernias volume quantification. Fetalix administration induced decrease in IVD height, volume and brightness. Moreover, 2 out of 3 animals presented higher hernia volumes and degeneration scores, except one that did not have hernias. Von Frey test revealed that Fetalix group presented sensitivity similar to naïve and decreased compared to lesioned animals, suggesting that these animals were able to restore their sensitivity. Overall, these results showed that it was possible to produce Fetalix as an injectable solution. The in vivo analysis demonstrated that, despite not regenerating the IVD, biomaterial’s administration enabled sensitivity restoration to naïve levels.
A dor lombar (DL) é uma patologia musculoesquelética que afeta 80% da população. É causada, principalmente, pela degeneração do disco intervertebral (DIV), essencial para a mobilidade da coluna vertebral. Visto que as atuais terapias não proporcionam soluções a longo prazo, é urgente desenvolver novos tratamentos para restaurar um tecido funcional. Previamente, o grupo mostrou que o núcleo pulposo (NP) fetal bovino, parte central do DIV, é rico em colagénio XII e XIV, duas proteínas pró-regenerativas que desaparecem com a idade. Além disso, NPs fetais descelularizados, co-cultivados com células de NP bovino, exibiram elevados níveis de agrecano e colagénio II e diminuíram a formação de novos vasos. Deste trabalho surgiu o Fetalix - o primeiro biomaterial de origem fetal para tratar a DL. Esta tese pretendeu aferir o potencial do Fetalix in vivo por ressonância magnética (RM), histologia e análise comportamental, otimizar a produção escalonável e a injetabilidade. Modificações nos protocolos de descelularização permitiram reduzir entre 6 e 8% a sua duração e aumentar a capacidade de processamento. Contudo, é necessário otimizá-los para obter uma redução de DNA dupla-hélice <50ng por mg de peso seco de matrix extracelular. Observou-se também uma redução expectável de glicosaminoglicanos. Quanto à produção e caraterização das partículas, o 4-Place Mini Bead Mill homogeniser foi escolhido por produzir partículas mais pequenas e porosas. Foram necessários 50 ciclos para obter uma solução injetável através de uma seringa de 30 G. O ensaio de injetabilidade revelou picos e forças médias de 200 g, indicando soluções facilmente injetáveis. O estudo in vivo mostrou concordância entre os resultados de RM (obtidos pelo algoritmo desenvolvido) e de histologia, à exceção do volume das hérnias. A administração de Fetalix induziu diminuição na altura, volume e brilho do DIV, em comparação com os outros grupos. Além disso, 2 de 3 animais exibiram volumes de hérnia e índices de degeneração mais elevados, exceto um animal que não apresentou hérnias. No teste de Von Frey, o grupo Fetalix apresentou uma sensibilidade semelhante ao naïve e reduzida em relação a animais lesionados, o que sugere que, contudo, estes foram capazes de recuperar a sua sensibilidade. Em geral, os resultados mostraram que foi possível produzir o Fetalix como solução injetável. O estudo in vivo demonstrou que, apesar de não regenerar o DIV, a sua administração permitiu recuperar a sensibilidade para níveis semelhantes aos naïve.
A dor lombar (DL) é uma patologia musculoesquelética que afeta 80% da população. É causada, principalmente, pela degeneração do disco intervertebral (DIV), essencial para a mobilidade da coluna vertebral. Visto que as atuais terapias não proporcionam soluções a longo prazo, é urgente desenvolver novos tratamentos para restaurar um tecido funcional. Previamente, o grupo mostrou que o núcleo pulposo (NP) fetal bovino, parte central do DIV, é rico em colagénio XII e XIV, duas proteínas pró-regenerativas que desaparecem com a idade. Além disso, NPs fetais descelularizados, co-cultivados com células de NP bovino, exibiram elevados níveis de agrecano e colagénio II e diminuíram a formação de novos vasos. Deste trabalho surgiu o Fetalix - o primeiro biomaterial de origem fetal para tratar a DL. Esta tese pretendeu aferir o potencial do Fetalix in vivo por ressonância magnética (RM), histologia e análise comportamental, otimizar a produção escalonável e a injetabilidade. Modificações nos protocolos de descelularização permitiram reduzir entre 6 e 8% a sua duração e aumentar a capacidade de processamento. Contudo, é necessário otimizá-los para obter uma redução de DNA dupla-hélice <50ng por mg de peso seco de matrix extracelular. Observou-se também uma redução expectável de glicosaminoglicanos. Quanto à produção e caraterização das partículas, o 4-Place Mini Bead Mill homogeniser foi escolhido por produzir partículas mais pequenas e porosas. Foram necessários 50 ciclos para obter uma solução injetável através de uma seringa de 30 G. O ensaio de injetabilidade revelou picos e forças médias de 200 g, indicando soluções facilmente injetáveis. O estudo in vivo mostrou concordância entre os resultados de RM (obtidos pelo algoritmo desenvolvido) e de histologia, à exceção do volume das hérnias. A administração de Fetalix induziu diminuição na altura, volume e brilho do DIV, em comparação com os outros grupos. Além disso, 2 de 3 animais exibiram volumes de hérnia e índices de degeneração mais elevados, exceto um animal que não apresentou hérnias. No teste de Von Frey, o grupo Fetalix apresentou uma sensibilidade semelhante ao naïve e reduzida em relação a animais lesionados, o que sugere que, contudo, estes foram capazes de recuperar a sua sensibilidade. Em geral, os resultados mostraram que foi possível produzir o Fetalix como solução injetável. O estudo in vivo demonstrou que, apesar de não regenerar o DIV, a sua administração permitiu recuperar a sensibilidade para níveis semelhantes aos naïve.
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Fetalix In vivo study Intervertebral disc Low back pain Scalability Disco intervertebral Dor lombar Escabilidade Estudo in vivo
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