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Authors
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Abstract(s)
Acne vulgaris is a chronic disease with a high prevalence, not only in teenagers and young adults, but also in adults. It occurs in the pilosebaceous unit, mainly associated with Cutibacterium acnes (C. acnes) hyperproliferation, changes in sebum composition, hyperkeratinization of follicular ducts, leading to inflammation. However, acne´s heterogeneity makes it difficult to study, thus there is still a lack of suitable models that can properly replicate, not only the condition’s pathogenesis, but also the intrinsic characteristics of acne. Skin in vitro models arise as useful alternatives to animal testing, providing the scientific research with an important testing tool. They can have different complexity levels, depending on the research’s aim, creating different environments. However, most of them are still very simple, not reflecting the complex interactions present in the skin. In the present work, in vitro models were used to establish different acne conditions, as they are necessary not only to study the mechanisms involved in the disease, but also to analyze the efficacy of different treatments. Aiming to mimic the relationship between C. acnes and the sebaceous glands, bacteria-loaded microparticles were developed, with and without peroxidized squalene. Peroxidized squalene, which is present in sebaceous sites, provides in vitro models the essential lipidic component for C. acnes proliferation. Alginate and collagen microparticles were created and characterized to mimic the encapsulation of the C. acnes in the sebaceous glands. Then, they were inserted in the dermal layer of skin organotypic models, where keratinocytes were added to create an epidermal-like layer, resulting a full-thickness skin in vitro model. As time progressed, microparticles slid out from the models, which was not the desired outcome. However, bacteria and peroxidized squalene still interacted with the models, triggering an immune response and alteration in the skin structure. Nevertheless, to circumvent the microparticles’ limitations, new approaches were tested. Firstly, C. acnes lysate was produced and applied to the epidermal portion of the models to induce an inflammatory response. The lysate was tested at different concentrations for optimization purposes. We observed that the lysate 1:100 concentration was the one with the best outcome to mimic the acne phenotype, since an inflammatory response was triggered and the overall 3D structure of the epidermal layer of the organotypic model was damaged. Additionally, as the sebaceous glands, where usually C. acnes inhabits, are part of the pilosebaceous unit together with the hair follicles, a device to produce hair follicle-like structures was developed. The structures were evident within the models but after stratification, there was not enough space for C. acnes application. In conclusion, we were able to develop functional in vitro skin models, mimicking different severity degrees of the acne disease.
O acne é uma doença crónica que afeta cada vez mais pessoas, não só adolescentes e jovens, como também pessoas adultas. Ocorre na unidade pilossebácea e está principalmente associada à hiperproliferação de Cutibacterium acnes (C. acnes), alterações na composição do sebo, e hiperqueratinização dos ductos foliculares, provocando inflamação. No entanto, devido à grande heterogeneidade associada à doença, o seu estudo dificulta-se. Posto isto, existem ainda poucas alternativas de modelos in vitro capazes de replicar, não só a patogenicidade da doença, como também as características intrínsecas do acne. Os modelos in vitro são ótimas alternativas aos testes em animais, fornecendo uma importante ferramenta de testagem à comunidade científica. Dependendo dos requisitos necessários, este tipo de modelos consegue atingir diferentes níveis de complexidade, criando diferentes ambientes. No entanto, muitos deles são ainda bastantes simples e não conseguem refletir as complexas interações que estão presentes na pele. Neste trabalho recorreu-se ao uso de modelos in vitro para se estabelecerem diferentes condições de acne, uma vez que são importantes não só para o estudo dos mecanismos que nelas estão envolvidos, como também para se analisar a eficácia de diferentes tratamentos. Com o objetivo de mimetizar a relação entre o C. acnes e as glândulas sebáceas, foi idealizada a criação de micropartículas, nas quais foram inseridas bactérias, com ou sem a adição de esqualeno peroxidado. O esqualeno peroxidado é um elemento presente em locais sebosos, fornecendo um elemento lipídico aos modelos organotípicos, permitindo uma mais rápida proliferação do C. acnes. Para tal, micropartículas de alginato e colagénio foram desenvolvidas, com o intuito de simular a encapsulação de C. acnes nas glândulas sebáceas. Estas micropartículas foram caracterizadas e inseridas na camada da derme dos modelos, na qual foram adicionados queratinócitos, de modo a se obter uma camada tipo epidérmica, criando um modelo in vitro da pele completo. Ao longo do tempo, constatou-se que as micropartículas foram deslizando dos modelos, acabando por sair. No entanto, as bactérias e o esqualeno peroxidado interagiram com os modelos, tendo sido capazes de provocar uma resposta inflamatória. Apesar disso, novas abordagens foram testadas, de modo a colmatar as limitações presentes com este modelo. Inicialmente, o lisado de C. acnes foi produzido e aplicado na epiderme dos modelos, de modo a induzir uma resposta inflamatória. Diferentes concentrações foram testadas para otimizar o método. Observou-se que o lisado com concentração de 1:100 foi o que apresentou melhores resultados, conseguindo reproduzir um fenótipo característico do acne, uma vez que induziu uma resposta inflamatória e a estrutura 3D global da epiderme ficou danificada. Adicionalmente, como as glândulas sebáceas, onde normalmente o C. acnes está presente, incorporam a unidade pilossebácea em conjunto com os folículos pilosos, criou-se um dispositivo para a produção de estruturas semelhantes aos folículos pilosos. As estruturas foram evidentes nos modelos, no entanto, após estratificação, não houve espaço suficiente para a inserção de C. acnes. Em conclusão, nesta tese, conseguiram-se desenvolver modelos in vitro funcionais da pele, capazes de mimetizar diversos graus de severidade de acne.
O acne é uma doença crónica que afeta cada vez mais pessoas, não só adolescentes e jovens, como também pessoas adultas. Ocorre na unidade pilossebácea e está principalmente associada à hiperproliferação de Cutibacterium acnes (C. acnes), alterações na composição do sebo, e hiperqueratinização dos ductos foliculares, provocando inflamação. No entanto, devido à grande heterogeneidade associada à doença, o seu estudo dificulta-se. Posto isto, existem ainda poucas alternativas de modelos in vitro capazes de replicar, não só a patogenicidade da doença, como também as características intrínsecas do acne. Os modelos in vitro são ótimas alternativas aos testes em animais, fornecendo uma importante ferramenta de testagem à comunidade científica. Dependendo dos requisitos necessários, este tipo de modelos consegue atingir diferentes níveis de complexidade, criando diferentes ambientes. No entanto, muitos deles são ainda bastantes simples e não conseguem refletir as complexas interações que estão presentes na pele. Neste trabalho recorreu-se ao uso de modelos in vitro para se estabelecerem diferentes condições de acne, uma vez que são importantes não só para o estudo dos mecanismos que nelas estão envolvidos, como também para se analisar a eficácia de diferentes tratamentos. Com o objetivo de mimetizar a relação entre o C. acnes e as glândulas sebáceas, foi idealizada a criação de micropartículas, nas quais foram inseridas bactérias, com ou sem a adição de esqualeno peroxidado. O esqualeno peroxidado é um elemento presente em locais sebosos, fornecendo um elemento lipídico aos modelos organotípicos, permitindo uma mais rápida proliferação do C. acnes. Para tal, micropartículas de alginato e colagénio foram desenvolvidas, com o intuito de simular a encapsulação de C. acnes nas glândulas sebáceas. Estas micropartículas foram caracterizadas e inseridas na camada da derme dos modelos, na qual foram adicionados queratinócitos, de modo a se obter uma camada tipo epidérmica, criando um modelo in vitro da pele completo. Ao longo do tempo, constatou-se que as micropartículas foram deslizando dos modelos, acabando por sair. No entanto, as bactérias e o esqualeno peroxidado interagiram com os modelos, tendo sido capazes de provocar uma resposta inflamatória. Apesar disso, novas abordagens foram testadas, de modo a colmatar as limitações presentes com este modelo. Inicialmente, o lisado de C. acnes foi produzido e aplicado na epiderme dos modelos, de modo a induzir uma resposta inflamatória. Diferentes concentrações foram testadas para otimizar o método. Observou-se que o lisado com concentração de 1:100 foi o que apresentou melhores resultados, conseguindo reproduzir um fenótipo característico do acne, uma vez que induziu uma resposta inflamatória e a estrutura 3D global da epiderme ficou danificada. Adicionalmente, como as glândulas sebáceas, onde normalmente o C. acnes está presente, incorporam a unidade pilossebácea em conjunto com os folículos pilosos, criou-se um dispositivo para a produção de estruturas semelhantes aos folículos pilosos. As estruturas foram evidentes nos modelos, no entanto, após estratificação, não houve espaço suficiente para a inserção de C. acnes. Em conclusão, nesta tese, conseguiram-se desenvolver modelos in vitro funcionais da pele, capazes de mimetizar diversos graus de severidade de acne.
Description
Keywords
Acne C. acnes Skin Organotypic models Sebaceous glands Microparticles Alginate Lysate Inflammation Hair follicle Pele Modelos organotípicos Glândulas sebáceas Micropartículas Alginato Lisado Inflamação Folículo piloso