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Advisor(s)
Abstract(s)
The development of bioengineering and biotechnology has promoted the interest
for faster and more reliable methods for monitoring biochemical processes. Flowbased
systems stand out as the most effective in the automation and
miniaturization of these methods. A significantly reduction on the analysis time and
dispensing skilled labour is achieved, thus becoming an important tool for
implementation and enforcement of these assays.
The main objective was the development of new methodologies for the
miniaturization of biochemical analysis system using a sequential injection lab-onvalve
(SI-LOV) system. In this context, analytical methodologies were developed
based on enzymatic assays for the detection of enzyme substrates, for
measurements of enzyme activity, or for enzymatic inhibition studies.
Under this program, some enzymatic methodologies were developed:
determination of ethanol in alcoholic beverages; determination of hydrogen
peroxide in cleaning solutions for contact lenses, with and without dilution in line;
and determination of the activity of peroxidase in vegetable extracts.
The developed method for the enzymatic assay of ethanol in beverages (Chap.3)
was based on the conversion of ethanol to acetaldehyde by alcohol dehydrogenase
(ADH), using spectrophotometric detection. The quantification of hydrogen
peroxide (H2O2) (Chap.4) and peroxidase activity (Chap.5) was based on the reaction of oxidation of 2,2’-Azino-bis(3-Ethilbenzothiazoline 6-sulfonic acid) (ABTS) with
hydrogen peroxide in the presence of peroxidase (HRP).
Another major goal was to explore the potential of the SI-LOV systems to execute
solid phase spectrophotometry, demonstrating its suitability for handling complex
samples. This process, in the form of bead injection, was implemented inside the
flow system. For this purpose, we used the resin "NitriloaceticAcid (NTA)
Superflow", capable of retaining metal ions, which can be derivatized and measured
by spectrophotometry (solid-phase spectrophotometry). These methods were used
for the quantification of iron and protein content in wine samples.
The developed method for the quantification of iron in wine samples (Chap. 6) was
based on the reaction of Fe3+ with SCN-, where the Fe3+ ions were retained at the
surface of the NTA beads. The total iron content was achieved by performing the inline
oxidation of the Fe2+ to Fe3+. The methodology for total protein content in white
wine samples (Chap.7) was based on the Lowry method. The NTA beads were
initially charged with Cu2+ to complex with the proteins present in the sample. The
quantification was achieved by the colour reaction of the proteins with the Folin
Ciocalteau reagent.
As for detection system, UV/Vis spectrophotometry was used in all of the
developed methodologies.
O desenvolvimento da bioengenharia e da biotecnologia impulsionou o interesse por métodos mais rápidos e fiáveis para a monitorização de processos bioquímicos. Os sistemas de fluxo salientam-se como os mais eficazes na automatização e na miniaturização destes métodos. Diminuindo significativamente o tempo de análise, dispensando mão-de-obra qualificada, convertendo-se numa ferramenta fundamental para a execução e aplicação destes ensaios. O presente trabalho de doutoramento teve como principal objectivo o desenvolvimento de novas metodologias para a miniaturização de ensaios bioquímicos usando um sistema de análise de injecção sequencial “Lab-on-valve” (SI-LOV). Neste contexto foram desenvolvidas metodologias analíticas com base em ensaios enzimáticos, para a detecção de substratos da enzima, para medições de actividade enzimática e para ensaios de inibição. No âmbito deste programa foram desenvolvidas as seguintes metodologias enzimáticas: determinação de etanol em bebidas alcoólicas; determinação de peróxido de hidrogénio em soluções de limpeza de lentes de contacto, com e sem diluição em linha; e determinação da actividade da peroxidase em extractos vegetais. O método desenvolvido para o ensaio enzimático de etanol em bebidas alcoólicas (Cap. 3) foi baseado na conversão do etanol em acetaldeído na presença da enzima álcool desidrogenase. A quantificação de peróxido de hidrogénio (Cap.4) e da actividade da peroxidase (Cap.5) teve por base a reacção de oxidação do 2,2’- Azino-bis(3-Ethilbenzothiazoline 6-sulfonic acid) (ABTS) com o peróxido de hidrogénio na presença da enzima peroxidase (HRP). Outro objectivo principal foi o de explorar as potencialidades destes sistemas de fluxo em espectrofotometria em fase sólida, demonstrando a sua adequação a amostras com matrizes normalmente complexas. Este processo, na forma de “bead injection”, foi implementado no sistema de fluxo. Neste trabalho utilizou-se a resina “NitriloaceticAcid (NTA) Superflow” que retém catiões metálicos, e que pode ser derivatizada e efectuada a medição por espectrofotometria. Assim, foram desenvolvidas metodologias empregando esta técnica de separação/concentração para a quantificação de ferro e de teor proteico em amostras de vinho. O método desenvolvido para o doseamento de ferro em amostras de vinhos (Cap. 6) teve por base a reacção de Fe3+ com SCN-, em que os iões de Fe3+ são retidos na superfície das esferas de NTA. A quantificação de ferro total é conseguida efectuando a oxidação de Fe2+ a Fe3+em linha. A metodologia desenvolvida para a quantificação de proteínas totais em amostras de vinho branco (Cap.7) teve por base o método de “Lowry”. Inicialmente as esferas foram derivatisadas com Cu2+ de modo a complexarem as proteínas presentes na amostra. A quantificação foi efectuada pela reacção de coloração entre as proteínas retidas e o reagente de “Folin Ciocalteau”. No âmbito deste trabalho a espectrofotometria UV/Vis foi o sistema de detecção usado em todas as metodologias desenvolvidas.
O desenvolvimento da bioengenharia e da biotecnologia impulsionou o interesse por métodos mais rápidos e fiáveis para a monitorização de processos bioquímicos. Os sistemas de fluxo salientam-se como os mais eficazes na automatização e na miniaturização destes métodos. Diminuindo significativamente o tempo de análise, dispensando mão-de-obra qualificada, convertendo-se numa ferramenta fundamental para a execução e aplicação destes ensaios. O presente trabalho de doutoramento teve como principal objectivo o desenvolvimento de novas metodologias para a miniaturização de ensaios bioquímicos usando um sistema de análise de injecção sequencial “Lab-on-valve” (SI-LOV). Neste contexto foram desenvolvidas metodologias analíticas com base em ensaios enzimáticos, para a detecção de substratos da enzima, para medições de actividade enzimática e para ensaios de inibição. No âmbito deste programa foram desenvolvidas as seguintes metodologias enzimáticas: determinação de etanol em bebidas alcoólicas; determinação de peróxido de hidrogénio em soluções de limpeza de lentes de contacto, com e sem diluição em linha; e determinação da actividade da peroxidase em extractos vegetais. O método desenvolvido para o ensaio enzimático de etanol em bebidas alcoólicas (Cap. 3) foi baseado na conversão do etanol em acetaldeído na presença da enzima álcool desidrogenase. A quantificação de peróxido de hidrogénio (Cap.4) e da actividade da peroxidase (Cap.5) teve por base a reacção de oxidação do 2,2’- Azino-bis(3-Ethilbenzothiazoline 6-sulfonic acid) (ABTS) com o peróxido de hidrogénio na presença da enzima peroxidase (HRP). Outro objectivo principal foi o de explorar as potencialidades destes sistemas de fluxo em espectrofotometria em fase sólida, demonstrando a sua adequação a amostras com matrizes normalmente complexas. Este processo, na forma de “bead injection”, foi implementado no sistema de fluxo. Neste trabalho utilizou-se a resina “NitriloaceticAcid (NTA) Superflow” que retém catiões metálicos, e que pode ser derivatizada e efectuada a medição por espectrofotometria. Assim, foram desenvolvidas metodologias empregando esta técnica de separação/concentração para a quantificação de ferro e de teor proteico em amostras de vinho. O método desenvolvido para o doseamento de ferro em amostras de vinhos (Cap. 6) teve por base a reacção de Fe3+ com SCN-, em que os iões de Fe3+ são retidos na superfície das esferas de NTA. A quantificação de ferro total é conseguida efectuando a oxidação de Fe2+ a Fe3+em linha. A metodologia desenvolvida para a quantificação de proteínas totais em amostras de vinho branco (Cap.7) teve por base o método de “Lowry”. Inicialmente as esferas foram derivatisadas com Cu2+ de modo a complexarem as proteínas presentes na amostra. A quantificação foi efectuada pela reacção de coloração entre as proteínas retidas e o reagente de “Folin Ciocalteau”. No âmbito deste trabalho a espectrofotometria UV/Vis foi o sistema de detecção usado em todas as metodologias desenvolvidas.