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Authors
Abstract(s)
The search for innovative food products with added-value properties has been an increasing tendency in the last years. Accordingly, different food compounds with potential bioactive properties have been identified, such as, conjugated linoleic acid (CLA) and conjugated linolenic acid (CLNA), which have been described with anti-carcinogenic, anti-obesity and anti-inflammatory activities, among others. These compounds are naturally found in meat and milk of ruminants or vegetables oils, but, due to availability and concentration concerns, it is not feasible to attain beneficial effects from CLA/CLNA through these sources. Alternatively, in situ microbial enrichment of food matrices has been studied, since several probiotic strains have been described with the capacity to isomerize linoleic acid (LA) and α-linolenic acid (α-LNA) into their corresponding conjugated forms. Thus, the objective of this work was to study the development of a new added-value dairy product through in situ microbial production of CLA and CLNA using previously hydrolyzed commercial vegetable oils as substrate sources, so as to evaluate possible side fatty acid (FA) metabolites released during the process, study the biochemical and organoleptic properties, and assess the shelf-life stability of the developed dairy product. First the selection of CLA/CLNA-producing strains was performed from among 85 probiotic strains through molecular detection of genes encoding enzymes involved in CLA/CLNA formation, namely, linoleate isomerase (LAI), myosin-cross-reactive antigen (MCRA) and fatty acid-hydratase (FA-HY), using reported primers and primers designed based on conserved motifs. Meanwhile, it was determined the strains’ maximum tolerance to LA after exposure to increasing concentrations thereof, namely 1, 2 and 5 mg/mL. About 34 strains revealed the presence of at least one of the screened genes, where the designed primers were more effective, but no association was found between their LA-tolerance and the CLA production potential. Moreover, only 4 genotypically-positive strains revealed the capacity to convert 0.5 mg/mL LA into CLA isomers. These were further tested for CLNA production from 0.5 mg/mL α-LNA. The strain Bifidobacterium breve DSM 20091 demonstrated the best yields of CLA and CLNA isomers (>50% of substrate conversion), being selected for the following assays. In a second phase, the utilization of commercial vegetables oils as substrate sources for the development of a CLA/CLNA-enriched fermented milk was studied. To increase the bioavailability of LA and α-LNA present in the selected oils, i.e., soybean (43.7 g LA/100 g oil) and flaxseed (41.3 g α-LNA/100 g oil) oils, different lipases were tested. The Candida rugosa lipase showed the best yields for all of the tested oils (>90% of hydrolysis). Bifidobacterium breve DSM 20091 was thereafter assayed in milk containing 0.5 mg/mL of LA and/or α-LNA obtained from the hydrolyzed oils. Results showed that this strain was not able to produce CLA simultaneously with CLNA to the same extent. Therefore, higher substrate concentrations (i.e., α-LNA) were further tested with only hydrolyzed flaxseed oil. The best yields were attained at 2 mg/mL α-LNA, registering ca. 1 mg/g of mainly CLNA isomers. To evaluate possible FA metabolites, a gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis of milk fermented with pure LA and/or α-LNA or hydrolyzed flaxseed oil was performed. No further FA compounds were found that could result from LA or α-LNA metabolization; however, two additional CLNA isomers never reported before for bifidobacteria strains were discovered. The biochemical and organoleptic properties of the developed CLNA-enriched fermented milk were thereafter evaluated through analysis of sugars and organic acids content, titratable acidity, pH, nutritional composition, volatile compounds profile and sensory properties. The developed product showed comparable compositional properties; however, it lacked important flavor contributors, and bitterness and astringency prevailed. Finally, the stability of the CLNA-enriched fermented milk was assessed throughout 28 days of refrigerated (4 ºC) storage. To obtain an alternative delivery system of CLNA isomers, the enriched fermented milk was further lyophilized, and its stability during storage (12 weeks at room temperature) was also evaluated. For both products a free saturated FAs loss and an increment of conjugated isomers content was observed. In conclusion, the selection of potential CLA/CLNA-producing strains cannot rely solely on genotypic and/or substrate tolerance screening techniques. Even though, it was possible to obtain a fermented milk enriched in conjugated FAs with B. breve DSM 20091 using hydrolyzed flaxseed oil, and this strain showed a preference to produce CLNA isomers. Moreover, two additional CLNA isomers never reported before were discovered. The biochemical and nutritional characteristics of the CLNA-enriched fermented milk were acceptable, but there are organoleptic features that remain to be tackled. Although conjugated isomers in the developed dairy products increased throughout storage, the alterations in free saturated FA suggested the occurrence of oxidation processes.
A procura por produtos alimentares inovadores com propriedades de valor acrescentado tem sido uma tendência crescente nos últimos anos. Desta forma, diferentes compostos alimentares com potenciais propriedades bioativas têm sido identificados, como por exemplo o ácido linoleico conjugado (CLA) e o ácido linolénico conjugado (CLNA), os quais têm sido descritos com atividades anti-carcinogénica, anti-obesidade e anti-inflamatória, entre outras. Estes compostos encontram-se naturalmente na carne e no leite de ruminantes ou em óleos vegetais, mas, devido a questões de disponibilidade e concentração, não é exequível obter efeitos benéficos de CLA/CLNA através destas fontes. Alternativamente, tem sido estudado o enriquecimento microbiano in situ de matrizes alimentares, uma vez que foram descritas várias estirpes probióticas com capacidade de isomerizar o ácido linoleico (LA) e o ácido α-linolénico (α-LNA) ao correspondente ácido conjugado. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar o desenvolvimento de um novo produto lácteo de valor acrescentado através da produção microbiana in situ de CLA e CLNA utilizando óleos vegetais comerciais previamente hidrolisados como fontes de substrato, assim como avaliar possíveis metabolitos de ácidos gordos libertados durante o processo, estudar as propriedades bioquímicas e organoléticas, e avaliar a estabilidade em prateleira do produto lácteo desenvolvido. Em primeiro lugar, selecionaram-se estirpes produtoras de CLA/CLNA de entre 85 estirpes probióticas através da deteção molecular de genes que codificam enzimas envolvidas na formação de CLA/CLNA, nomeadamente, linoleato isomerase (LAI), antigénio reativo cruzado da miosina (MCRA) e hidratase de ácido gordos (FA-HY). Para tal, usaram-se primers descritos na literatura e primers desenhados com base em regiões conservadas. Entretanto, determinou-se a tolerância máxima das estirpes ao LA após exposição a 1, 2 e 5 mg/mL. Cerca de 34 estirpes revelaram a presença de pelo menos um dos genes analisados, sendo os primers desenhados neste estudo mais eficientes. Contudo não foi encontrada qualquer associação entre a sua tolerância ao LA e o potencial de produção de CLA. Além disso, apenas 4 estirpes genotipicamente positivas revelaram a capacidade de converter 0,5 mg/mL de LA em isómeros de CLA. Estas foram ainda testadas para a produção de CLNA a partir de 0,5 mg/mL de α-LNA. A estirpe Bifidobacterium breve DSM 20091 demonstrou os melhores valores de produção de isómeros de CLA e CLNA (>50% de conversão do substrato), sendo selecionada para os ensaios seguintes. De seguida, foi estudada a utilização de óleos vegetais comerciais como fontes de substrato para o desenvolvimento de um leite fermentado enriquecido em CLA/CLNA. Para aumentar a biodisponibilidade de LA e α-LNA nos óleos selecionados, isto é, óleo de soja (43,7 g LA/100 g de óleo) e de linhaça (41,3 g α-LNA/100 g de óleo), foram testadas diferentes lípases. A lípase de Candida rugosa apresentou os melhores rendimentos para qualquer um dos óleos testados (>90% de hidrólise). A B. breve DSM 20091 foi depois testada em leite contendo 0,5 mg/mL de LA e/ou α LNA com os óleos hidrolisados. Os resultados mostraram que esta estirpe não foi capaz de produzir CLA simultaneamente com CLNA na mesma extensão. Por conseguinte, foram testadas concentrações de substrato mais elevadas (α-LNA) apenas com óleo de linhaça hidrolisado. Os melhores rendimentos foram obtidos a 2 mg/mL de α-LNA, tendo-se registado cerca de 1 mg/g de isómeros de CLNA maioritariamente. Para avaliar possíveis metabolitos de ácidos gordos, foi efetuada uma análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS) ao leite fermentado com LA puro e/ou α-LNA puro ou óleo de linhaça hidrolisado. Não foram encontrados outros compostos de ácidos gordos que pudessem resultar da metabolização do LA ou α-LNA; no entanto, foram descobertos dois isómeros adicionais de CLNA nunca descritos para as Bifidobactérias. As propriedades bioquímicas e organoléticas do leite fermentado enriquecido com CLNA foram depois avaliadas através da análise do teor de açúcares e ácidos orgânicos, acidez titulável, pH, composição nutricional, perfil de compostos voláteis e propriedades sensoriais. O produto desenvolvido apresentou características comparáveis a outros produtos semelhantes, no entanto, faltaram-lhe propriedades organoléticas importantes, prevalecendo o amargor e a adstringência. Finalmente, foi avaliada a estabilidade do leite fermentado enriquecido com CLNA durante 28 dias de armazenamento refrigerado (4 ºC). Para obter uma via alternativa de administração dos isómeros de CLNA, o leite fermentado enriquecido foi depois liofilizado, sendo também avaliada a sua estabilidade durante o armazenamento (12 semanas à temperatura ambiente). Em ambos os produtos observou-se ao longo do tempo uma perda de ácidos gordos saturados livres e um aumento da quantidade de isómeros conjugados. Em conclusão, a identificação de estirpes potencialmente produtoras de CLA/CLNA não pode basear-se apenas em técnicas de seleção genotípica e/ou de tolerância ao substrato. Apesar disso, foi possível desenvolver um leite fermentado enriquecido em ácidos gordos conjugados com a B. breve DSM 20091 utilizando óleo de linhaça hidrolisado, e esta estirpe mostrou uma preferência para produzir isómeros de CLNA. Além disso, foram descobertos dois isómeros adicionais de CLNA nunca descritos. As características bioquímicas e nutricionais do leite fermentado enriquecido com CLNA foram aceitáveis, mas há propriedades organoléticas a serem melhoradas. Embora os isómeros conjugados nos produtos lácteos desenvolvidos tenham aumentado durante o armazenamento, as alterações nos ácidos gordos saturados livres sugeriram a ocorrência de processos de oxidação.
A procura por produtos alimentares inovadores com propriedades de valor acrescentado tem sido uma tendência crescente nos últimos anos. Desta forma, diferentes compostos alimentares com potenciais propriedades bioativas têm sido identificados, como por exemplo o ácido linoleico conjugado (CLA) e o ácido linolénico conjugado (CLNA), os quais têm sido descritos com atividades anti-carcinogénica, anti-obesidade e anti-inflamatória, entre outras. Estes compostos encontram-se naturalmente na carne e no leite de ruminantes ou em óleos vegetais, mas, devido a questões de disponibilidade e concentração, não é exequível obter efeitos benéficos de CLA/CLNA através destas fontes. Alternativamente, tem sido estudado o enriquecimento microbiano in situ de matrizes alimentares, uma vez que foram descritas várias estirpes probióticas com capacidade de isomerizar o ácido linoleico (LA) e o ácido α-linolénico (α-LNA) ao correspondente ácido conjugado. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar o desenvolvimento de um novo produto lácteo de valor acrescentado através da produção microbiana in situ de CLA e CLNA utilizando óleos vegetais comerciais previamente hidrolisados como fontes de substrato, assim como avaliar possíveis metabolitos de ácidos gordos libertados durante o processo, estudar as propriedades bioquímicas e organoléticas, e avaliar a estabilidade em prateleira do produto lácteo desenvolvido. Em primeiro lugar, selecionaram-se estirpes produtoras de CLA/CLNA de entre 85 estirpes probióticas através da deteção molecular de genes que codificam enzimas envolvidas na formação de CLA/CLNA, nomeadamente, linoleato isomerase (LAI), antigénio reativo cruzado da miosina (MCRA) e hidratase de ácido gordos (FA-HY). Para tal, usaram-se primers descritos na literatura e primers desenhados com base em regiões conservadas. Entretanto, determinou-se a tolerância máxima das estirpes ao LA após exposição a 1, 2 e 5 mg/mL. Cerca de 34 estirpes revelaram a presença de pelo menos um dos genes analisados, sendo os primers desenhados neste estudo mais eficientes. Contudo não foi encontrada qualquer associação entre a sua tolerância ao LA e o potencial de produção de CLA. Além disso, apenas 4 estirpes genotipicamente positivas revelaram a capacidade de converter 0,5 mg/mL de LA em isómeros de CLA. Estas foram ainda testadas para a produção de CLNA a partir de 0,5 mg/mL de α-LNA. A estirpe Bifidobacterium breve DSM 20091 demonstrou os melhores valores de produção de isómeros de CLA e CLNA (>50% de conversão do substrato), sendo selecionada para os ensaios seguintes. De seguida, foi estudada a utilização de óleos vegetais comerciais como fontes de substrato para o desenvolvimento de um leite fermentado enriquecido em CLA/CLNA. Para aumentar a biodisponibilidade de LA e α-LNA nos óleos selecionados, isto é, óleo de soja (43,7 g LA/100 g de óleo) e de linhaça (41,3 g α-LNA/100 g de óleo), foram testadas diferentes lípases. A lípase de Candida rugosa apresentou os melhores rendimentos para qualquer um dos óleos testados (>90% de hidrólise). A B. breve DSM 20091 foi depois testada em leite contendo 0,5 mg/mL de LA e/ou α LNA com os óleos hidrolisados. Os resultados mostraram que esta estirpe não foi capaz de produzir CLA simultaneamente com CLNA na mesma extensão. Por conseguinte, foram testadas concentrações de substrato mais elevadas (α-LNA) apenas com óleo de linhaça hidrolisado. Os melhores rendimentos foram obtidos a 2 mg/mL de α-LNA, tendo-se registado cerca de 1 mg/g de isómeros de CLNA maioritariamente. Para avaliar possíveis metabolitos de ácidos gordos, foi efetuada uma análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS) ao leite fermentado com LA puro e/ou α-LNA puro ou óleo de linhaça hidrolisado. Não foram encontrados outros compostos de ácidos gordos que pudessem resultar da metabolização do LA ou α-LNA; no entanto, foram descobertos dois isómeros adicionais de CLNA nunca descritos para as Bifidobactérias. As propriedades bioquímicas e organoléticas do leite fermentado enriquecido com CLNA foram depois avaliadas através da análise do teor de açúcares e ácidos orgânicos, acidez titulável, pH, composição nutricional, perfil de compostos voláteis e propriedades sensoriais. O produto desenvolvido apresentou características comparáveis a outros produtos semelhantes, no entanto, faltaram-lhe propriedades organoléticas importantes, prevalecendo o amargor e a adstringência. Finalmente, foi avaliada a estabilidade do leite fermentado enriquecido com CLNA durante 28 dias de armazenamento refrigerado (4 ºC). Para obter uma via alternativa de administração dos isómeros de CLNA, o leite fermentado enriquecido foi depois liofilizado, sendo também avaliada a sua estabilidade durante o armazenamento (12 semanas à temperatura ambiente). Em ambos os produtos observou-se ao longo do tempo uma perda de ácidos gordos saturados livres e um aumento da quantidade de isómeros conjugados. Em conclusão, a identificação de estirpes potencialmente produtoras de CLA/CLNA não pode basear-se apenas em técnicas de seleção genotípica e/ou de tolerância ao substrato. Apesar disso, foi possível desenvolver um leite fermentado enriquecido em ácidos gordos conjugados com a B. breve DSM 20091 utilizando óleo de linhaça hidrolisado, e esta estirpe mostrou uma preferência para produzir isómeros de CLNA. Além disso, foram descobertos dois isómeros adicionais de CLNA nunca descritos. As características bioquímicas e nutricionais do leite fermentado enriquecido com CLNA foram aceitáveis, mas há propriedades organoléticas a serem melhoradas. Embora os isómeros conjugados nos produtos lácteos desenvolvidos tenham aumentado durante o armazenamento, as alterações nos ácidos gordos saturados livres sugeriram a ocorrência de processos de oxidação.
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Keywords
Conjugated linoleic acid Conjugated linolenic acid Bifidobacterium breve Flaxseed oil Fermented milk Ácido linoleico conjugado Ácido linolénico conjugado Bifidobacterium breve Óleo de linhaça Leite fermentado