Loading...
Publication
Tradition, science, and innovation : bioactive substances to mitigate microbiological risks of innovative alheiras
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 2.48 MB | Adobe PDF |
Abstract(s)
Alheira, a well-known delicacy produced in the north of Portugal, is a valuable part of our country's gastronomic heritage. Traditional alheiras, produced mainly with shredded pork and poultry meats, traditional wheat bread, olive oil, pork fat, and spices, are well-studied products and in the past years, some new formulations have emerged. Consumer preferences are constantly changing, so the food industry must proactively develop new products. In addition to traditional fermented sausages, mainly made with meat, other products are being developed to offer alternatives in line with consumer trends to reduce meat consumption. Vegetarian, vegan, and flexitarian diets are on the rise and sausages made from a variety of ingredients, such as codfish, mushrooms, tofu, soya, or vegetables, and other meat analogues are appearing worldwide. The aim of this study was to characterize these products, as little is known about their microbiological and chemical characteristics, and it becomes essential to determine their potential role in food safety. Classical microbiological and chemical analysis were therefore carried out on a universe of 21 alheiras, 14 of which were considered innovative and seven traditional. Enterobacteriaceae, Enterococcus, Lactic Acid Bacteria (LAB), yeasts, and moulds were the prevalent microbiota found in these innovative products. Sulphite-reducing Clostridium spores, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. or Staphylococcus aureus were not detected in any innovative samples. No differences were observed between traditional and innovative alheiras concerning pH and water activity, while nitrites, nitrates and biogenic amines were within accepted limits for these products. Regarding organic acids, lactic acid was found in all samples analyzed, while malic and succinic acid seemed predominant only in the innovative alheiras. In addition, and to find some similarities between different types of alheiras and/or different producers, a study was carried out using next-generation sequencing technology to characterize the microbial communities associated with these products. The bacterial and fungal communities associated with each alheira were obtained by sequencing 16S rRNA gene V3- V4 and Internal Transcribed Spacer 2 (ITS2) regions of rRNA gene amplicons. Significant differences in the microbiota composition were found between samples, which were reflected by large differences in the profiles of the dominant species. More than 500 taxa were identified, particularly belonging to the families Lactobacillaceae and Xanthomonadaceae, which were found in all samples. In the analysis of the bacterial communities, genera belonging to lactic acid bacteria and Xanthomonas were predominant. Concerning fungi, the yeast Pichia was found in almost all the samples, followed by the filamentous fungus Alternaria. A challenge test was conducted in order to investigate the behaviour of foodborne pathogens (E. coli, L. monocytogenes, Salmonella Enteritidis and Staph. aureus) in traditional and innovative alheiras (codfish and vegetarian) along the product shelf-life at 4 ºC. Each target pathogen showed a different behaviour on the alheira matrices, but most pathogens were not detected in vegetarian alheira before the expiration date. As part of the risk mitigation, 491 LAB were isolated from traditional and innovative alheiras, and their antimicrobial activity against several foodborne pathogens was investigated. Six strains revealed antimicrobial activity by possible bacteriocin production against L. monocytogenes, Enterococcus faecalis, Clostridium sporogenes and Clostridium perfringens. These strains were identified as Lactiplantibacillus plantarum (2), Leuconostoc mesenteroides (1) and Pediococcus acidilactici (3). Additionally, orthologues of several class II bacteriocins genes were detected, namely Plantaricin E, Plantaricin F, Pediocin PA, Enterocin X, Leucocin A, and Coagulin A. None of these strains produced biogenic amines, gelatinase or DNase, as well as no hemolytic activity or lipase enzyme production was observed. However, only Lpb. plantarum 9A3 was sensitive to all the antibiotics tested and was therefore selected for further testing. Bacteriocins produced by Lpb. plantarum (9A3) demonstrated a bacteriostatic mode of action and stability across a wide range of conditions (temperature, pH, surfactants, detergents, and proteases). In conclusion, unlike traditional alheiras, which often contain pathogens, neither harmful organisms nor chemical hazards were found in these new products, even though they were produced by the same companies. Characterization of microbial communities by WGS revealed distinct microbial diversity patterns in traditional and innovative alheiras, even when produced in the same facilities and conditions. While this study offers initial insights into microbial diversity in these products, it sheds light on the behaviour of foodborne pathogens in the alheira matrix. Lactic acid bacteria increased throughout the shelf-life, particularly in traditional alheiras. Although each target pathogen showed a different behaviour on alheira matrices in general, vegetarian alheira proved to have particular characteristics that influence the viability of foodborne pathogens, since all pathogens tested were below the detection limit of the enumeration technique at the end of shelf-life in this matrix. Lactiplantibacillus plantarum 9A3 emerged as a promising candidate for industrial use due to the production of stable bacteriocins targeting pathogens like L. monocytogenes and C. perfringens and absence of virulence factors.
A alheira é um enchido tradicional do norte de Portugal produzido principalmente com carnes de porco e aves desfiadas, pão de trigo tradicional, azeite, gordura de porco e especiarias. Como resposta ao aumento da procura por alimentos percecionados como saudáveis e por fontes de proteínas alternativas às proteínas de origem animal, nos últimos anos têm sido disponibilizadas no mercado alheiras com novas formulações (“inovadoras”). As dietas vegetarianas, veganas e flexitarianas estão em ascensão e enchidos produzidos com ingredientes como, por exemplo, bacalhau, cogumelos, tofu, soja, ou vegetais têm surgido em todo o mundo. Neste contexto, este estudo teve como objetivo a caracterização de novas formulações de alheiras, uma vez que o conhecimento das suas características microbiológicas e químicas que determinam a sua segurança é limitado. Foi realizada a caraterização microbiológica e química por técnicas clássicas de 21 alheiras, 14 “inovadoras” e sete tradicionais. Enterobacteriaceae, Enterococcus, bactérias do ácido lático, leveduras e bolores constituem a microbiota dominante destes produtos. Não foram detetados esporos de Clostridium sulfito-redutores, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. ou Staphylococcus aureus em nenhuma das amostras “inovadoras”. Não foram observadas diferenças significativas para os valores de pH e de atividade de água entre as alheiras tradicionais e “inovadoras”. As concentrações de nitrito, nitrato e aminas biogénicas estavam dentro dos limites aceitáveis para estes produtos em todas as amostras analisadas. Foi encontrado ácido láctico em todas as amostras, mas os ácidos málico e succínico predominaram nas alheiras “inovadoras”. Adicionalmente, foram caraterizadas as comunidades microbianas dos produtos por sequenciação de nova geração (NGS). As comunidades bacterianas e fúngicas associadas a cada alheira foram analisadas, respetivamente, por sequenciação das regiões V3-V4 do gene 16S rRNA e do espaçador interno transcrito 2 (ITS2). Foram encontradas diferenças significativas na composição da microbiota entre as amostras, o que se refletiu em grandes diferenças nos perfis das espécies dominantes. Foram identificados mais de 500 taxa, principalmente pertencentes às famílias Lactobacillaceae e Xanthomonadaceae. Os géneros pertencentes ao grupo das bactérias do ácido lático e Xanthomonas foram predominantes nas comunidades bacterianas. No que diz respeito aos fungos, a levedura Pichia foi encontrada na maioria das amostras, seguida do fungo filamentoso Alternaria. O comportamento dos patogénicos E. coli, L. monocytogenes, Salmonella Enteritidis e Staph. aureus em alheiras tradicionais e “inovadoras” (bacalhau e vegetariana) ao longo do prazo de validade dos produtos armazenados a 4 ºC revelou ser variável por testes de desafio. Salmonella Enteritidis e Staph. aureus não foram detetados na alheira vegetariana antes do término do prazo de validade. Com o intuito de encontrar soluções de biocontrolo de bactérias patogénicas nestes produtos, foi avaliada a atividade antimicrobiana de 491 bactérias do ácido láctico isoladas de alheiras tradicionais e inovadoras. Seis isolados revelaram atividade contra L. monocytogenes, Enterococcus faecalis, Clostridium sporogenes e Clostridium perfringens, possivelmente pela produção de bacteriocinas. Estes isolados foram identificados como Lactiplantibacillus plantarum (2), Leuconostoc mesenteroides (1) e Pediococcus acidilactici (3). Foram detetados ortólogos de vários genes de bacteriocinas de classe II, nomeadamente plantaricina E, plantaricina F, pediocina PA, enterocina X, leucocina A e coagulina A. Estas estirpes não produziram aminas biogénicas, gelatinase ou DNase e não revelaram atividade hemolítica ou produção da enzima lipase. Lactiplantibacillus plantarum 9A3 foi o único isolado sensível a todos os antibióticos testados e, como tal, foi selecionado para testes adicionais. As bacteriocinas produzidas por Lpb. plantarum (9A3) demonstraram um modo de ação bacteriostático e estabilidade numa ampla gama de condições (temperatura, pH, surfactantes, detergentes e proteases). Em resumo, não foram encontrados microrganismos patogénicos nem perigos químicos nas alheiras “inovadoras”, ao contrário das alheiras tradicionais produzidas pelas mesmas empresas, em que são frequentemente encontradas bactérias patogénicas. A caracterização das comunidades microbianas por NGS revelou padrões distintos de diversidade microbiana em alheiras tradicionais e “inovadoras”, mesmo quando produzidas nas mesmas instalações e condições. Com este estudo foram obtidas informações sobre a diversidade microbiana nestes produtos, bem como sobre o comportamento de agentes patogénicos em alheira. As bactérias do ácido láctico aumentaram ao longo do período de armazenamento, particularmente nas alheiras tradicionais. Embora cada agente patogénico estudado tenha apresentado um comportamento diferente nas várias formulações, a alheira vegetariana revelou ter características particulares que condicionam a viabilidade dos agentes patogénicos. Nesta matriz, todas as bactérias foram reduzidas a valores inferiores ao limite de deteção da técnica de enumeração no final do prazo de validade. Lactiplantibacillus plantarum 9A3 destacou-se como potencial agente de biocontrolo visto apresentar atividade bacteriocinogénica estável contra bactérias patogénicas como L. monocytogenes e C. perfringens e ausência de fatores de virulência.
A alheira é um enchido tradicional do norte de Portugal produzido principalmente com carnes de porco e aves desfiadas, pão de trigo tradicional, azeite, gordura de porco e especiarias. Como resposta ao aumento da procura por alimentos percecionados como saudáveis e por fontes de proteínas alternativas às proteínas de origem animal, nos últimos anos têm sido disponibilizadas no mercado alheiras com novas formulações (“inovadoras”). As dietas vegetarianas, veganas e flexitarianas estão em ascensão e enchidos produzidos com ingredientes como, por exemplo, bacalhau, cogumelos, tofu, soja, ou vegetais têm surgido em todo o mundo. Neste contexto, este estudo teve como objetivo a caracterização de novas formulações de alheiras, uma vez que o conhecimento das suas características microbiológicas e químicas que determinam a sua segurança é limitado. Foi realizada a caraterização microbiológica e química por técnicas clássicas de 21 alheiras, 14 “inovadoras” e sete tradicionais. Enterobacteriaceae, Enterococcus, bactérias do ácido lático, leveduras e bolores constituem a microbiota dominante destes produtos. Não foram detetados esporos de Clostridium sulfito-redutores, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. ou Staphylococcus aureus em nenhuma das amostras “inovadoras”. Não foram observadas diferenças significativas para os valores de pH e de atividade de água entre as alheiras tradicionais e “inovadoras”. As concentrações de nitrito, nitrato e aminas biogénicas estavam dentro dos limites aceitáveis para estes produtos em todas as amostras analisadas. Foi encontrado ácido láctico em todas as amostras, mas os ácidos málico e succínico predominaram nas alheiras “inovadoras”. Adicionalmente, foram caraterizadas as comunidades microbianas dos produtos por sequenciação de nova geração (NGS). As comunidades bacterianas e fúngicas associadas a cada alheira foram analisadas, respetivamente, por sequenciação das regiões V3-V4 do gene 16S rRNA e do espaçador interno transcrito 2 (ITS2). Foram encontradas diferenças significativas na composição da microbiota entre as amostras, o que se refletiu em grandes diferenças nos perfis das espécies dominantes. Foram identificados mais de 500 taxa, principalmente pertencentes às famílias Lactobacillaceae e Xanthomonadaceae. Os géneros pertencentes ao grupo das bactérias do ácido lático e Xanthomonas foram predominantes nas comunidades bacterianas. No que diz respeito aos fungos, a levedura Pichia foi encontrada na maioria das amostras, seguida do fungo filamentoso Alternaria. O comportamento dos patogénicos E. coli, L. monocytogenes, Salmonella Enteritidis e Staph. aureus em alheiras tradicionais e “inovadoras” (bacalhau e vegetariana) ao longo do prazo de validade dos produtos armazenados a 4 ºC revelou ser variável por testes de desafio. Salmonella Enteritidis e Staph. aureus não foram detetados na alheira vegetariana antes do término do prazo de validade. Com o intuito de encontrar soluções de biocontrolo de bactérias patogénicas nestes produtos, foi avaliada a atividade antimicrobiana de 491 bactérias do ácido láctico isoladas de alheiras tradicionais e inovadoras. Seis isolados revelaram atividade contra L. monocytogenes, Enterococcus faecalis, Clostridium sporogenes e Clostridium perfringens, possivelmente pela produção de bacteriocinas. Estes isolados foram identificados como Lactiplantibacillus plantarum (2), Leuconostoc mesenteroides (1) e Pediococcus acidilactici (3). Foram detetados ortólogos de vários genes de bacteriocinas de classe II, nomeadamente plantaricina E, plantaricina F, pediocina PA, enterocina X, leucocina A e coagulina A. Estas estirpes não produziram aminas biogénicas, gelatinase ou DNase e não revelaram atividade hemolítica ou produção da enzima lipase. Lactiplantibacillus plantarum 9A3 foi o único isolado sensível a todos os antibióticos testados e, como tal, foi selecionado para testes adicionais. As bacteriocinas produzidas por Lpb. plantarum (9A3) demonstraram um modo de ação bacteriostático e estabilidade numa ampla gama de condições (temperatura, pH, surfactantes, detergentes e proteases). Em resumo, não foram encontrados microrganismos patogénicos nem perigos químicos nas alheiras “inovadoras”, ao contrário das alheiras tradicionais produzidas pelas mesmas empresas, em que são frequentemente encontradas bactérias patogénicas. A caracterização das comunidades microbianas por NGS revelou padrões distintos de diversidade microbiana em alheiras tradicionais e “inovadoras”, mesmo quando produzidas nas mesmas instalações e condições. Com este estudo foram obtidas informações sobre a diversidade microbiana nestes produtos, bem como sobre o comportamento de agentes patogénicos em alheira. As bactérias do ácido láctico aumentaram ao longo do período de armazenamento, particularmente nas alheiras tradicionais. Embora cada agente patogénico estudado tenha apresentado um comportamento diferente nas várias formulações, a alheira vegetariana revelou ter características particulares que condicionam a viabilidade dos agentes patogénicos. Nesta matriz, todas as bactérias foram reduzidas a valores inferiores ao limite de deteção da técnica de enumeração no final do prazo de validade. Lactiplantibacillus plantarum 9A3 destacou-se como potencial agente de biocontrolo visto apresentar atividade bacteriocinogénica estável contra bactérias patogénicas como L. monocytogenes e C. perfringens e ausência de fatores de virulência.
Description
Keywords
Alheira Bacteriocins Bioprotective cultures Innovative products Metagenomics Bacteriocinas Culturas bioprotetoras Metagenómica Produtos inovativos
Pedagogical Context
Citation
Publisher
CC License
Without CC licence