| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 4.99 MB | Adobe PDF |
Authors
Abstract(s)
Antibiotic resistance represents a serious threat to human health and a relevant environmental contaminant. Antibiotic-resistant bacteria (ARB) and harboured antibiotic resistance genes (ARGs) were described in different settings, mainly in clinical contexts, but also in wastewater treatment plants or agricultural soil. In the environment, the general pollution context may favour the persistence or proliferation of ARB due to multiple genetic characteristics. Monitoring of ARGs and ARB in the environment plays an important role in unveiling sources and paths of dissemination. To address these issues this thesis explored three topics based on antibiotic resistant Pseudomonas aeruginosa and on soil: i) the biases that may be imposed by the high limits of quantification of ARGs in soil; ii) the survival of an exogenous ubiquitous bacterial strain (blaVIM+ P. aeruginosa) in soil and the possible effects of metal salts; and iii) the inferred interplay between phylogeny and accessory genome in distinct genotypes of carbapenem resistance (blaVIM+ or blaNDM+ P. aeruginosa). The first work (chapter 3) aimed to assess the limit of quantification (LOQ) for ARGs (vanA, qnrS, blaTEM, blaOXA, blaIMP, blaVIM) in soil, based on the hypothesis that low doses of ARB and ARGs in soil are not quantifiable with current qPCR techniques, mainly due to DNA extraction procedures. To determine the LOQ, microcosms (10 g of agricultural soil, potting soil, sand, fallow soil and compost) were spiked with wastewater isolated ARB doses ranging from 102 to 107 CFU/g of dry soil. These spiked ARB harboured respectively the vancomycin resistance gene vanA (E. faecalis), quinolone resistance gene qnrS (Escherichia coli), and β-lactam resistance genes blaTEM (E. coli), blaOXA (E. coli, Acinetobacter johnsonii), blaIMP (A. johnsonii), blaVIM (P. aeruginosa) based on which the LOQs were determined. The microcosms were sampled to enumerate bacterial colony forming units (CFU), and extract DNA for ARGs quantification by qPCR. The LOQ was determined to be 104 copies of ARG per g of dry soil, independently of the soil type. Below this limit, it was not possible to quantify ARGs even when the respective host ARB could be cultivated. The results support the hypothesis that LOQ values are relatively high and may suggest the absence of ARGs in situations in which these may represent a threat. The second work (chapter 4) aimed at assessing the metal impact on the survival of a hospital effluent blaVIM+ P. aeruginosa and on the soil microbial community’s diversity. Microcosms were prepared with agricultural soil non-amended or amended with copper and zinc sulfate or nitrate aged for one month, and spiked with known doses of blaVIM+ P. aeruginosa. The ARB survival was monitored based on CFU enumeration and quantification of selected genes - extracytoplasmic function sigma factor, ecf, Verona Integron–encoded Metallo-β-Lactamase, blaVIM, class 1 integron- integrase gene, intl1, over 30 days. In addition, the microbial community composition (V3-V4 16S rRNA gene amplicon sequencing) was analysed. Over this period, the P. aeruginosa content (CFUs/g dry soil) and ecf and blaVIM (copy number/g dry soil) decreased in all the tested conditions but was still quantifiable after 30 days. This confirms the ARB persistence in soil along the 30 days, excluding the hypothesis of ARG loss during this period. Microbiome analysis revealed a clear influence of metals in the bacterial community diversity, independent of the metal type and salts nature. This study permitted to conclude that the metal amendment affects the soil microbial quality but has a negligible impact on the exogenous bacteria survival. These results highlight the importance of considering microbial interaction and characteristics, such as metal tolerance, in the assessment of ARB persistence in the environment. In chapter 5 the genomes of blaVIM-2+ or blaNDM-1+ P. aeruginosa strains were compared. The ARG blaVIM-2 is mostly observed in Pseudomonas species, while blaNDM-1 is distributed among distinct genera and orders. The work focused on phylogenetic distribution and genomic features of a dataset of 116 blaVIM-2+ and 27 blaNDM-1+ genomes, from 38 countries. The selected genomes were annotated and the core sequence multilocus sequence typing (MLST) were determined. The blaVIM-2+ and blaNDM-1+ genomes were analysed using a comparative genome approach to assess the core and accessory genes, later used to determine the bacteria antibiotic resistance and functional profile. To describe the blaVIM-2 and blaNDM-1 genomic environment, the flanking regions were annotated through sequence comparison. The phylogenetic and geographic distribution analyses suggested a worldwide distribution of the strains belonging to several STs with cases of endemism. The blaVIM-2 + and blaNDM-1 + accessory genomes presented different antibiotic resistance and functional profiles, regardless the majority of the ARGs and proteins families were shared. Interestingly, the copresence of blaVIM-2 and blaNDM-1 and other carbapenems resistance genes in different genomes was observed. The genomic environments of the two ARGs were different, being blaVIM-2 associated with distinct transposons structures (Tn21, Tn402-like mostly) and blaNDM-1 to different elements (ISAba125 and bleMBL and IS91). This work emphasized the importance of considering different approaches to tackle the spread of carbapenem resistant bacteria evaluating the phylogeny, and geographical distribution but mostly the genomic characteristics of the strains. Our works aimed to indicate possible weaknesses to be improved in antibiotic resistance monitoring and highlight the ARB phylogenetic role and genetic characteristics favouring the ARGs spread. In particular, the experimental work evidences the possible survival of ARB in soil, mostly in extremely polluted conditions. Moreover, the survival and presence of these ARB in soil could avoid the quantification by molecular biology methods due to their high LOQ. The study of the ARB genomic characteristics may be useful to prevent the adaptation to environments and to find additional biomarkers for their monitoring.
A resistência a antibióticos representa uma séria ameaça para a saúde humana e um contaminante ambiental relevante. As bactérias resistentes a antibióticos (ARB) e os genes de resistência a antibióticos (ARGs) foram descritos em diferentes contextos, principalmente em casos clínicos, mas também em estações de tratamento de águas residuais ou solos agrícolas. No ambiente, o contexto geral da poluição pode favorecer a persistência ou a proliferação de ARB devido a múltiplas características genéticas. A monitorização de ARGs e de ARB no ambiente pode ter um papel importante na identificação de fontes e vias de disseminação. Para abordar estas questões, esta tese explorou três temas baseados em Pseudomonas aeruginosa resistente a antibióticos e em solo: i) as limitações que podem existir devido aos elevados limites de quantificação de ARGs no solo; ii) a sobrevivência de uma estirpe bacteriana exógena ubíqua (blaVIM+ P. aeruginosa) no solo e os possíveis efeitos de sais de metais; e iii) a relação que poderá existir entre a filogenia e o genoma acessório em diferentes genótipos de resistência a carbapenemos (blaVIM+ ou blaNDM+ P. aeruginosa). O primeiro trabalho (capítulo 3) visou avaliar o limite de quantificação (LOQ) de ARGs (vanA, qnrS, blaTEM, blaOXA, blaIMP, blaVIM) em solo, baseado na hipótese de que doses baixas de ARB e ARGs no solo não são quantificáveis com as atuais técnicas de qPCR, principalmente devido aos procedimentos de extração de DNA. Para determinar o LOQ, microcosmos (10 g de solo agrícola, substrato, areia, solo pousio e composto) foram inoculados com ARB isoladas de águas residuais em doses que variam de 102 a 107 CFU/g de solo seco. As ARB usadas como inóculo continham respetivamente o gene de resistência a vancomicina vanA (E. faecalis), o gene de resistência a quinolonas qnrS (Escherichia coli), e os genes de resistência a β-lactâmicos blaTEM (E. coli), blaOXA (E. coli, Acinetobacter johnsonii), blaIMP (A. johnsonii), blaVIM (P. aeruginosa) com base nos quail os LOQs foram determinados. Os microcosmos foram amostrados para enumerar unidades de formação de colónias bacterianas (CFU), e extrair DNA para quantificação de ARGs por qPCR. O LOQ foi determinado como sendo de 104 cópias de ARG por g de solo seco, independentemente do tipo de solo. Abaixo deste limite, não foi possível quantificar os ARGs mesmo quando o respetivo hospedeiro ARB foi detetado por cultivo. Os resultados apoiam a hipótese de que os valores de LOQ são relativamente elevados e podem sugerir a ausência de ARGs em situações em que estes possam representar um perigo. O segundo trabalho (capítulo 4) visou avaliar o impacto de metais na sobrevivência de um isolado de P. aeruginosa proveniente de efluente hospitalar blaVIM+ e na diversidade da comunidade microbiana do solo. Microcosmos foram preparados com solo agrícola ou neste suplementado com sulfato ou nitrato de cobre e zinco envelhecidos durante um mês, e inoculados com doses conhecidas de P. aeruginosa blaVIM+. A sobrevivência da ARB foi monitorizada com base na enumeração das CFU e quantificação de genes selecionados - extracytoplasmic function sigma factor, ecf, Verona Integron–encoded Metallo-β-Lactamase, blaVIM, class 1 integron-integrase gene, intl1, ao longo de 30 dias. Além disso, foi analisada a composição da comunidade microbiana (sequenciação de amplicão V3-V4 do gene 16S rRNA). Durante este período, a abundância de P. aeruginosa (CFUs/g solo seco) e ecf e blaVIM-2 (número de cópia/g de solo seco) diminuiu em todas as condições testadas, mas foi ainda assim quantificável após 30 dias. Estes resultados confirmam a persistência da ARB no solo ao longo dos 30 dias, excluindo a hipótese de perda do ARG durante este período. A análise do microbioma revelou uma clara influência dos metais na diversidade da comunidade bacteriana, independentemente do tipo de metal ou sal. Este estudo permitiu concluir que a suplementação com metais afeta a qualidade microbiana do solo, mas tem um impacto negligenciável na sobrevivência das bactérias exógenas. Estes resultados destacam a importância de considerar a interação e características microbianas, como a tolerância a metais, na avaliação da persistência da ARB no ambiente. No capítulo 5 foram comparados os genomas de estirpes de P. aeruginosa blaVIM-2+ ou blaNDM-1+. O ARG blaVIM-2 é observado principalmente em espécies de Pseudomonas, enquanto blaNDM-1 é distribuído entre géneros e ordens distintos. O trabalho centrou-se na distribuição filogenética e características genómicas de um conjunto de 116 genomas blaVIM-2+ e 27 genomas blaNDM-1+, de 38 países. Os genomas selecionados foram anotados e as sequências do core genome multilocus sequence type (MLST) foram determinadas. Os genomas blaVIM-2+ e blaNDM-1+ foram analisados usando uma abordagem comparativa do genoma para avaliar os genes do genoma core e acessório, mais tarde usados para determinar a resistência a antibióticos e o perfil funcional das bactérias. Para descrever o ambiente genómico de blaVIM-2 e blaNDM-1, as regiões onde se integravam foram anotadas através da comparação de sequências. As análises da distribuição filogenética e geográfica sugeriram uma distribuição mundial das estirpes pertencentes aos vários STs com casos de endemismo. Os genomas acessórios de blaVIM-2+ e blaNDM-1+ apresentaram diferentes perfis de resistência a antibióticos e funcionais, independentemente da maioria dos ARGs e das famílias de proteínas terem sido partilhados. Curiosamente, a presença simultânea de blaVIM-2 e blaNDM-1 e outros genes de resistência a carbapenemos foi observada em diferentes genomas. Os ambientes genómicos dos dois ARGs eram distintos, sendo blaVIM-2 associado a diferentes transposões (Tn21, Tn402-like na sua maioria) e blaNDM-1 a diferentes sequências de inserção (ISAba125 e bleMBL e IS91). Este trabalho enfatizou a importância de considerar diferentes abordagens para combater a propagação de bactérias resistentes a carbapenemos que avalim a filogenia, e a distribuição geográfica, mas principalmente as características genómicas das estirpes. Os nossos trabalhos visavam indicar possíveis limitações a serem melhoradas na monitorização da resistência aos antibióticos e destacar o papel da filogenia das ARB e das características genéticas que favorecem a propagação dos ARGs. Em particular, o trabalho experimental evidencia a possível sobrevivência de ARB no solo, principalmente em condições de elevada poluição. Além disso, a sobrevivência e a presença destas ARB no solo pode não ser possível de quantificar por métodos de biologia molecular devido ao seu elevado LOQ. O estudo das características genómicas das ARB pode ser útil para prevenir a adaptação aos ambientes e para encontrar mais biomarcadores para a sua monitorização.
A resistência a antibióticos representa uma séria ameaça para a saúde humana e um contaminante ambiental relevante. As bactérias resistentes a antibióticos (ARB) e os genes de resistência a antibióticos (ARGs) foram descritos em diferentes contextos, principalmente em casos clínicos, mas também em estações de tratamento de águas residuais ou solos agrícolas. No ambiente, o contexto geral da poluição pode favorecer a persistência ou a proliferação de ARB devido a múltiplas características genéticas. A monitorização de ARGs e de ARB no ambiente pode ter um papel importante na identificação de fontes e vias de disseminação. Para abordar estas questões, esta tese explorou três temas baseados em Pseudomonas aeruginosa resistente a antibióticos e em solo: i) as limitações que podem existir devido aos elevados limites de quantificação de ARGs no solo; ii) a sobrevivência de uma estirpe bacteriana exógena ubíqua (blaVIM+ P. aeruginosa) no solo e os possíveis efeitos de sais de metais; e iii) a relação que poderá existir entre a filogenia e o genoma acessório em diferentes genótipos de resistência a carbapenemos (blaVIM+ ou blaNDM+ P. aeruginosa). O primeiro trabalho (capítulo 3) visou avaliar o limite de quantificação (LOQ) de ARGs (vanA, qnrS, blaTEM, blaOXA, blaIMP, blaVIM) em solo, baseado na hipótese de que doses baixas de ARB e ARGs no solo não são quantificáveis com as atuais técnicas de qPCR, principalmente devido aos procedimentos de extração de DNA. Para determinar o LOQ, microcosmos (10 g de solo agrícola, substrato, areia, solo pousio e composto) foram inoculados com ARB isoladas de águas residuais em doses que variam de 102 a 107 CFU/g de solo seco. As ARB usadas como inóculo continham respetivamente o gene de resistência a vancomicina vanA (E. faecalis), o gene de resistência a quinolonas qnrS (Escherichia coli), e os genes de resistência a β-lactâmicos blaTEM (E. coli), blaOXA (E. coli, Acinetobacter johnsonii), blaIMP (A. johnsonii), blaVIM (P. aeruginosa) com base nos quail os LOQs foram determinados. Os microcosmos foram amostrados para enumerar unidades de formação de colónias bacterianas (CFU), e extrair DNA para quantificação de ARGs por qPCR. O LOQ foi determinado como sendo de 104 cópias de ARG por g de solo seco, independentemente do tipo de solo. Abaixo deste limite, não foi possível quantificar os ARGs mesmo quando o respetivo hospedeiro ARB foi detetado por cultivo. Os resultados apoiam a hipótese de que os valores de LOQ são relativamente elevados e podem sugerir a ausência de ARGs em situações em que estes possam representar um perigo. O segundo trabalho (capítulo 4) visou avaliar o impacto de metais na sobrevivência de um isolado de P. aeruginosa proveniente de efluente hospitalar blaVIM+ e na diversidade da comunidade microbiana do solo. Microcosmos foram preparados com solo agrícola ou neste suplementado com sulfato ou nitrato de cobre e zinco envelhecidos durante um mês, e inoculados com doses conhecidas de P. aeruginosa blaVIM+. A sobrevivência da ARB foi monitorizada com base na enumeração das CFU e quantificação de genes selecionados - extracytoplasmic function sigma factor, ecf, Verona Integron–encoded Metallo-β-Lactamase, blaVIM, class 1 integron-integrase gene, intl1, ao longo de 30 dias. Além disso, foi analisada a composição da comunidade microbiana (sequenciação de amplicão V3-V4 do gene 16S rRNA). Durante este período, a abundância de P. aeruginosa (CFUs/g solo seco) e ecf e blaVIM-2 (número de cópia/g de solo seco) diminuiu em todas as condições testadas, mas foi ainda assim quantificável após 30 dias. Estes resultados confirmam a persistência da ARB no solo ao longo dos 30 dias, excluindo a hipótese de perda do ARG durante este período. A análise do microbioma revelou uma clara influência dos metais na diversidade da comunidade bacteriana, independentemente do tipo de metal ou sal. Este estudo permitiu concluir que a suplementação com metais afeta a qualidade microbiana do solo, mas tem um impacto negligenciável na sobrevivência das bactérias exógenas. Estes resultados destacam a importância de considerar a interação e características microbianas, como a tolerância a metais, na avaliação da persistência da ARB no ambiente. No capítulo 5 foram comparados os genomas de estirpes de P. aeruginosa blaVIM-2+ ou blaNDM-1+. O ARG blaVIM-2 é observado principalmente em espécies de Pseudomonas, enquanto blaNDM-1 é distribuído entre géneros e ordens distintos. O trabalho centrou-se na distribuição filogenética e características genómicas de um conjunto de 116 genomas blaVIM-2+ e 27 genomas blaNDM-1+, de 38 países. Os genomas selecionados foram anotados e as sequências do core genome multilocus sequence type (MLST) foram determinadas. Os genomas blaVIM-2+ e blaNDM-1+ foram analisados usando uma abordagem comparativa do genoma para avaliar os genes do genoma core e acessório, mais tarde usados para determinar a resistência a antibióticos e o perfil funcional das bactérias. Para descrever o ambiente genómico de blaVIM-2 e blaNDM-1, as regiões onde se integravam foram anotadas através da comparação de sequências. As análises da distribuição filogenética e geográfica sugeriram uma distribuição mundial das estirpes pertencentes aos vários STs com casos de endemismo. Os genomas acessórios de blaVIM-2+ e blaNDM-1+ apresentaram diferentes perfis de resistência a antibióticos e funcionais, independentemente da maioria dos ARGs e das famílias de proteínas terem sido partilhados. Curiosamente, a presença simultânea de blaVIM-2 e blaNDM-1 e outros genes de resistência a carbapenemos foi observada em diferentes genomas. Os ambientes genómicos dos dois ARGs eram distintos, sendo blaVIM-2 associado a diferentes transposões (Tn21, Tn402-like na sua maioria) e blaNDM-1 a diferentes sequências de inserção (ISAba125 e bleMBL e IS91). Este trabalho enfatizou a importância de considerar diferentes abordagens para combater a propagação de bactérias resistentes a carbapenemos que avalim a filogenia, e a distribuição geográfica, mas principalmente as características genómicas das estirpes. Os nossos trabalhos visavam indicar possíveis limitações a serem melhoradas na monitorização da resistência aos antibióticos e destacar o papel da filogenia das ARB e das características genéticas que favorecem a propagação dos ARGs. Em particular, o trabalho experimental evidencia a possível sobrevivência de ARB no solo, principalmente em condições de elevada poluição. Além disso, a sobrevivência e a presença destas ARB no solo pode não ser possível de quantificar por métodos de biologia molecular devido ao seu elevado LOQ. O estudo das características genómicas das ARB pode ser útil para prevenir a adaptação aos ambientes e para encontrar mais biomarcadores para a sua monitorização.
Description
Keywords
Antibiotic resistance Pseudomonas aeruginosa Microbiome analysis Wastewater reuse Resistência a antibióticos Análise da comunidade microbiana Tratamento de águas residuais