Publication
Novel approaches on the characterization of the wastewater resistome : possible implications on human health and water quality management
| datacite.subject.fos | Ciências Médicas::Biotecnologia Médica | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Rodrigues, Célia Maria Manaia | |
| dc.contributor.advisor | Henriques, Isabel da Silva | |
| dc.contributor.advisor | Ribas, Margarita Gomila | |
| dc.contributor.author | Rocha, Jaqueline Maria Matias da | |
| dc.date.accessioned | 2022-12-22T17:07:00Z | |
| dc.date.available | 2024-12-22T01:30:44Z | |
| dc.date.issued | 2022-01-28 | |
| dc.date.submitted | 2021-11 | |
| dc.description.abstract | Antibiotic resistant bacteria and antibiotic resistance genes are considered contaminants of emerging concern, nowadays widely disseminated in the environment. Urban wastewater treatment plants are major recipients and reservoirs for these contaminants. In urban these plants, wastewater is subjected to different types of treatment that reduce the levels of antibiotic resistant bacteria and antibiotic resistance genes, although not completely. Considering that most of the bacteria are not culturable and that this fraction might harbor antibiotic resistance genes, culture-independent methods are currently used to assess antibiotic resistance in the environment. Among these methods, quantitative PCR is considered the gold standard used to quantify antibiotic resistance genes in environmental samples, although the lack of harmonized methods seriously limits the reliable comparison of results obtained in different laboratories. Among the antibiotic resistant bacteria emitted by wastewater treatment plants, Enterobacteriaceae represent an important fraction and among these Klebsiella pneumoniae deserve special attention. Indeed, K. pneumoniae is a bacterial species that besides the clinical importance when associated to humans, can also be found in the environment, in soils, plants, water, and wastewater. The capacity of this bacterial species to thrive in different environments and in humans and animals increases its significance in terms of human health threat might constitute a human health threat. However, the traits that might be maintained or lost during the transit of K. pneumoniae through clinical and environmental contexts are still unknown. This thesis aimed to 1) advance the knowledge regarding the use of harmonized analytical quantitative PCR methods that might enable reliable comparisons of genes quantification ; 2) design a cell-based internal standard that could be used in different laboratories to assess losses during water samples filtration, DNA extraction and quantitative PCR quantification; and 3) contribute to a better understanding of the ecology of K. pneumoniae and infer about possible dynamics between clinic and environmental niches, with special focus on genetic diversity and antibiotic resistance stability. To tackle the first aim, genetic determinants encoding resistance to sulfonamides (sul1 and sul2), quinolones (qnrS), and β-lactams (blaTEM) and the 16S rRNA gene were monitored in DNA extracts supplied by partners who were investigating wastewater treatment processes, at full- or pilot-scale. In parallel, the influence on genes quantification of DNA shipment, quantitative PCR protocols, standards and equipment was studied in an interlaboratory comparison. These results and the literature available justified the efforts to meet the second aim. An internal standard, consisting in a cloned gene fragment not found in wastewater samples was designed and tested. This internal standard is to be used to spike wastewater or water samples aiming to control DNA losses during the processing of the sample and DNA extraction process. The emission of antibiotic resistant bacteria by wastewater treatment plants is an issue of concern, however it is not clear if these bacteria will survive and maintain their features once in the environment. To investigate this topic, K. pneumoniae was used as a model species and two distinct research approaches were used. A group of 3 rd generation cephalosporin-resistant K. pneumoniae isolates (25 wastewater; 34 clinical) was compared based on phenotypic, genotypic and genomic analyses (n=22) and a broader group of genomes collected from a public database (21 countries, 61 environmental; 78 clinical) was compared based on a core and pangenome approach and profiles of antibiotic and metal resistance, virulence, efflux systems, oxidative stress and quorum sensing traits. According to the results obtained and their analysis, it was concluded that wastewater treatment efficiency and wastewater quality regarding antibiotic resistance emissions should always be measured based on absolute abundance (per volume), rather than in relative abundance (per total bacteria). The interlaboratory comparison seemed to be reliable, although DNA extract quality and stability during shipment, as well as consumables and equipment specificities, may be critical for the monitoring findings. The use of a cell-based internal standard may contribute to overcome those limitations. This internal standard permitted to estimate the water matrix effect which was associated with an underestimation that ranged 0.1–0.9 log gene copy number mL−1 of sample, irrespective of the water type. Clinical and wastewater isolates were indistinguishable based on phenotypic and genotypic characterization, although distinct lineages may prevail in clinical or environmental settings. Genetic determinants related to efflux, oxidative stress or quorum sensing functions were common to clinical and wastewater isolates, while antibiotic and metal resistance or virulence genes, were variable across the genomes and associated with mobile genetic elements, mostly transposons, insertion sequences or integrative and conjugative elements. The analysis of a larger and geographically more diverse group of genomes, suggested that antibiotic and metal resistance and virulence gene alleles were more prevalent and diverse in clinical isolates, while some quorum sensing, efflux systems and oxidative stress genetic determinants alleles were more prevalent and diverse in environmental isolates. The studies performed unveil a promising opportunity to implement comparable and reliable antibiotic resistance monitoring schemes. The harmonization of some procedures and the use of internal standards will enable worldwide comparisons of antibiotic resistance genes in wastewaters, and therefore improve and promote surveillance studies worldwide. The double evidence that antibiotic resistance features observed in clinical K. pneumoniae are maintained in the environment and that it is among the environmental isolates that stress dwelling features seem to be more diverse, supports the high capacity of K. pneumoniae for spreading through wastewater or in the environment, enhancing the risks of transmission back to humans. | pt_PT |
| dc.description.abstract | As bactérias resistentes a antibióticos e os seus genes de resistência a antibióticos são considerados contaminantes emergentes, hoje amplamente disseminados no meio ambiente. As estações de tratamento de águas residuais domésticas são importantes recetores e emissores destes contaminantes. Nestas estações, os esgotos são submetidos a diferentes tipos de tratamento que embora reduzam os níveis de bactérias resistentes a antibióticos e genes de resistência a antibióticos, não evitam que haja ainda fortes cargas emitidas para o meio recetor. Tendo em conta que a maioria das bactérias não é cultivável e que essa fração de bactérias pode conter genes de resistência a antibióticos, os métodos independentes de cultivo têm vindo a ser usados para avaliar a ocorrência de resistência aos antibióticos no ambiente. o método quantitativo de Polymerase Chain Reaction (qPCR) é um dos preferidos para quantificar genes de resistência a antibióticos em amostras ambientais. Contudo, é reconhecido que a harmonização de métodos será decisiva para que se possa comparar de modo confiável os resultados obtidos em diferentes partes do mundo. Entre as bactérias resistentes a antibióticos emitidas por estações de tratamento de águas residuais, as da família Enterobacteriaceae representam uma fração importante e entre estas as da espécie Klebsiella pneumoniae merecem atenção especial. De facto, K. pneumoniae é uma espécie bacteriana que além da importância clínica quando associada aos humanos, também pode ser encontrada no meio ambiente, em solos, plantas, água e águas residuais. A capacidade de membros desta espécie de proliferar em diferentes ambientes e em humanos e animais pode constituir uma ameaça à saúde humana. No entanto, as características que podem ser mantidas ou perdidas durante a transição de K. pneumoniae por um contexto clínico ou ambiental ainda são desconhecidas. Esta tese teve como objetivo 1) avançar no conhecimento relativamente ao uso de métodos analíticos harmonizados de qPCR que possam permitir comparações confiáveis da quantificação de genes; 2) desenvolver um padrão interno baseado em células que pudesse ser usado em diferentes laboratórios para normalizar resultados e avaliar as perdas durante o processamento das amostras de água, extração de DNA e quantificação por qPCR; e 3) contribuir para um melhor conhecimento da ecologia de K. pneumoniae e inferir sobre as possíveis dinâmicas entre nichos clínicos e ambientais, com especial foco na diversidade genética e estabilidade da resistência a antibióticos. Para atingir o primeiro objetivo, determinantes genéticos que codificam resistência a sulfonamidas (sul1 e sul2), quinolonas (qnrS) e β-lactâmicos (blaTEM) e o gene 16S rRNA foram monitorizados em extratos de DNA fornecidos por parceiros que estavam a investigar processos de tratamento de águas residuais, à escala real ou em sistemas piloto. Paralelamente, foi estudada a influência do transporte de DNA, protocolos, padrões e equipamento de qPCR na comparação da quantificação de genes em ensaios interlaboratoriais. Estes resultados e a literatura disponível justificaram os esforços para atingir o segundo objetivo. Um padrão interno, que consistia num fragmento de um gene que não se encontra no ambiente, clonado em Escherichia coli, foi desenvolvido e testado. Este padrão interno deverá ser adicionado a amostras de água residual ou água com o objetivo de controlar as perdas de DNA. A emissão de bactérias resistentes a antibióticos por estações de tratamento de águas residuais é uma questão preocupante, contudo não é claro se estas bactérias sobreviverão e manterão as suas características uma vez libertadas no meio ambiente. Para investigar este tópico, K. pneumoniae foi usada como espécie-modelo e duas abordagens de investigação distintas foram utilizadas. Um grupo de isolados de K. pneumoniae resistentes a cefalosporinas de 3ª geração (25 de águas residuais; 34 clínicas) foi comparado com base em características fenotípicas, genotípicas e genómicas (n = 22). Em paralelo, um grupo mais amplo de genomas obtidos de uma base de dados pública (21 países; 61 ambientais, 78 clínicos) foi comparado com base na análise do pangenoma e nos perfis de características de resistência a antibióticos e metais, virulência, sistemas de efluxo, stresse oxidativo e quorum sensing. De acordo com os resultados obtidos e sua interpretação, concluiu-se que a eficiência do tratamento e a qualidade de águas residuais, em relação à resistência a antibióticos, devem ser sempre medidas com base na abundância absoluta (por volume), e não na abundância relativa (por total de bactérias). A comparação inter-laboratorial pareceu ser confiável, embora a qualidade e estabilidade dos extratos de DNA durante o transporte, bem como as especificidades dos consumíveis e do equipamento, possam ser críticos para os resultados de monitorização. O uso de um padrão interno baseado em células poderá contribuir para superar estas limitações. Este padrão interno permitiu estimar o efeito de matriz da água, que esteve associado a uma subestimativa que variou de 0.1–0.9 log do número de cópias do gene por mililitro de amostra, independentemente do tipo de água. Os isolados clínicos e de águas residuais foram indistinguíveis com base na caracterização fenotípica e genotípica, embora os dados sugerissem que linhagens distintas possam prevalecer em contexto clínico ou ambiental. Os determinantes genéticos relacionados com funções de efluxo, stresse oxidativo e quorum sensing estavam presentes em isolados clínicos e de águas residuais, enquanto que a resistência a antibióticos e metais ou genes de virulência variavam de estirpe para estirpe, estando associados a elementos genéticos móveis, principalmente transposões, sequências de inserção ou elementos integrativos e conjugativos, respetivamente. A análise de um grupo maior e geograficamente mais diverso de genomas sugeriu que os alelos dos genes de virulência e resistência a antibióticos e metais são mais prevalentes e diversos em isolados clínicos, enquanto alguns alelos de determinantes genéticos relacionados com quorum sensing, sistemas de efluxo e stresse oxidativo são mais prevalentes e diversos em isolados ambientais. Os estudos realizados são promissores relativamente à possibilidade de implementar esquemas inter-laboratoriais de monitorização de resistência a antibióticos que forneçam resultados comparáveis e confiáveis. A harmonização de alguns procedimentos e o uso de padrões internos permitirão comparações de quantificação de genes de resistência a antibióticos em águas residuais e, portanto, melhorar e promover estudos de vigilância mundialmente. A dupla evidência de que as características de resistência a antibióticos observadas em K. pneumoniae clínicas são mantidas no meio ambiente e que é entre os isolados ambientais que as características de tolerância ao stresse parecem ser mais diversas, sugere a alta capacidade de K. pneumoniae para se disseminar a partir de águas residuais e no ambiente, aumentando os riscos de transmissão ao ser humano. | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 101683936 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.14/39637 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.subject | Antibiotic resistance | pt_PT |
| dc.subject | Wastewater | pt_PT |
| dc.subject | Internal standard | pt_PT |
| dc.subject | Klebsiella pneumoniae | pt_PT |
| dc.subject | Comparative genomic | pt_PT |
| dc.subject | Resistência a antibióticos | pt_PT |
| dc.subject | Águas residuais | pt_PT |
| dc.subject | Padrão interno | pt_PT |
| dc.subject | Genómica comparada | pt_PT |
| dc.title | Novel approaches on the characterization of the wastewater resistome : possible implications on human health and water quality management | pt_PT |
| dc.type | doctoral thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| person.familyName | Rocha | |
| person.givenName | Jaqueline | |
| person.identifier.ciencia-id | 721C-C3E4-6A38 | |
| person.identifier.orcid | 0000-0003-1651-9483 | |
| person.identifier.rid | K-3850-2014 | |
| person.identifier.scopus-author-id | 57113035100 | |
| rcaap.rights | openAccess | pt_PT |
| rcaap.type | doctoralThesis | pt_PT |
| relation.isAuthorOfPublication | 61cb19ec-ea8b-4294-a77d-378aa7994f16 | |
| relation.isAuthorOfPublication.latestForDiscovery | 61cb19ec-ea8b-4294-a77d-378aa7994f16 | |
| thesis.degree.name | Doutoramento em Biotecnologia | pt_PT |