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- Ecology and antimicrobial resistance of Ralstonia spp. in drinking waterPublication . Mayhua, Felix Pompeyo Ferro; Rodrigues, Célia Maria Manaia; Moreira, Ivone Cristina VazAs Betaproteobactérias são ubíquas no ciclo urbano da água, com múltiplas oportunidades de interacção com os seres humanos. A combinação das propriedades fisiológicas e ecológicas de algumas Betaproteobactérias explica sua capacidade de sobreviver no meio ambiente, persistir após desinfecção da água potável e, por vezes, colonizar animais, incluindo humanos. Versatilidade metabólica, capacidade de formar biofilme e tolerância a agentes antimicrobianos e metais, são exemplos de características subjacentes à ubiquidade acima mencionada. Porém, esta informação não se encontra claramente disponível na literatura científica, pelo que um dos objectivos deste trabalho, foi o de investigar e sistematizar informação sobre a ocorrência de Betaproteobactérias em água potável. Três géneros bacterianos de Betaproteobacteria, cuja presença em água exemplifica a referida ubiquidade são Achromobacter, Burkholderia e Ralstonia, por vezes relacionados a surtos de infecção associados a água potável. Ralstonia spp. despertou particular atenção visto ter sido recentemente isolada no grupo de fontes tão diversas como água mineral ou água de esgoto hospitalar. Ralstonia spp., principalmente as espécies Ralstonia pickettii e R. mannitolilytica, têm sido recentemente associadas casos de infecção e esta ubiquidade suscitou interesse. Membros destas espécies podem apresentar tolerância a metais, antibióticos e desinfetantes, o que pode contribuir para a sua ubiquidade e eventual severidade como agentes infecciosos. Neste estudo procurou compreender-se se existia uma inter-relação entre resistência a metais e antibióticos e como é que tal poderia influenciar o comportamento das estirpes. O trabalho experimental envolveu a caracterização de estirpes das espécies R. pickettii e R. mannitolilytica, isoladas de água de esgoto hospitalar, água da torneira e de água mineral engarrafada, e teve como objectivo identificar possíveis associações de fenótipos de resistência a antibióticos e metais e outros tipos de stresse, bem como as suas bases genéticas. Especificamente, num primeiro ensaio estudaram-se isolados de água de Ralstonia pickettii e R. mannitolilytica de efluente hospitalar (n = 2), água da torneira (n = 2), água mineral (n = 1), e avaliaram-se os fenótipos de resistência a antibióticos e a metais bem como resposta a desinfecção e alguns parâmetros de cinética de crescimento. Para atingir esses objetivos, utilizou-se o método de difusão em disco e de microdiluição para determinar concentrações inibitórias mínimas (MIC), fizeram-se curvas de crescimento em meio Mueller-Hinton suplementado com os agentes antimicrobianos de interesse, de modo a estudar os parâmetros de cinética de crescimento, avaliou-se a capacidade de formação de biofilme e testou-se o comportamento em presença de radiação ultravioleta, hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogénio. Este estudo sugeriu existir uma associação entre resistência a gentamicina (MIC > 256 mg/L) e tolerância aumentada a arsenito (MIC = 1.4 mmol/L) A hipótese de se tratar de resistência cruzada foi descartada visto, concentrações sub-inibitórias de gentamicina ou de arsenito diminuíram significativamente a taxa de crescimento e produção de Ralstonia spp. embora apenas o arsenito causasse um aumento significativo na fase de lag. Além disso, em estirpes resistentes a gentamicina, a formação de biofilme foi estimulada na presença de aminoglicosídeos ou de arsenito. A desinfecção com radiação ultravioleta ou hipoclorito apresentou taxas de inativação semelhantes nas linhagens resistentes e suscetíveis a gentamicina. Em contraste, a mesma dose de peróxido de hidrogénio causou inativação mais rápida em estirpes sensíveis a gentamicina do que em resistentes. A associação entre resistência a gentamicina e arsenito foi explorada num grupo mais alargado de R. pickettii, pelo que se incluíram 37 estirpes de, 14 de água mineral, 17 de água de torneira e 6 de esgoto hospitalar. Analisaram-se os perfis de resistência a antibióticos e a arsenito, conforme se descreve acima e fez-se o rastreio de determinantes genéticos de resistência selecionados, incluindo os relacionados com Elementos Conjugativos Integrativos (ICE), plasmídeos, e genes associados com uma bomba de efluxo e resistência ao arsénio. A maioria dos isolados (32/37) era resistente a gentamicina, beta-lactâmicos e colistina. Porém, nem todos os isolados eram resistentes a gentamicina e a associação deste fenótipo com o aumento da tolerância ao arsenito foi confirmada. Esta divisão de estirpes resistentes a gentamicina e arsenito vs. suscetíveis concidia com a separação de dois grupos filogenéticos, com base na análise do gene rRNA 16S. Os isolados resistentes a gentamicina e arsenito apresentaram ICEs e os genes arsH e acr3, relacionados à resistência ao arsenito. A maioria dos isolados de R. pickettii (36) apresentava um ou dois plasmídeos com tamanhos entre 77 e 260 kpb. As sequências de aminoácidos da bomba de efluxo, cujo gene amplificou em todas as estirpes, diferiam em isolados resistentes e suscetíveis. Embora os genótipos de estirpes resistentes e suscetíveis a gentamicina diferissem de forma consistente com os fenótipos e com a distinção filogenética de ambos os grupos, não foi possível encontrar uma explicação genética para o fenótipo observado, nem para a associação de resistência arsenito e gentamicina. Porém, para todos os elementos genéticos analisados verificou-se uma divisão clara entre ambos os grupos, sugerindo que abordagens de genómica comparativa poderiam contribuir para elucidar as bases genéticas dos fenótipos em análise – resistência vs. suscetibilidade a gentamicina e arsenito. Neste sentido, compararam-se os genomas de uma estirpe resistente e de uma estirpe suscetível e com especial enfoque nas categorias funcionais “Transporte Membranar”, “Stress e Defesa” e “Virulência” analisaram-se os genes presentes apenas na estirpe resistente ou as mutações detetadas entre ambos. Esta análise mostrou haver algumas funções que podem explicar quer a capacidade para adquirir ou desenvolver novos mecanismos de resistência. Este tipo de estudo permite elucidar os processos de desenvolvimento ou aquisição de resistência em espécies ubíquas caracterizadas por mecanismos de resistência assumidamente intrínseca, visto serem comuns à maioria de membros de uma espécie.
- Association between gentamicin resistance and stress tolerance in water isolates of Ralstonia pickettii and R. mannitolilyticaPublication . Ferro, Pompeyo; Vaz-Moreira, Ivone; Manaia, Célia M.Members of the species Ralstonia pickettii and R. mannitolilytica, although ubiquitous and lacking major virulence factors, have been associated with nosocomial outbreaks. Tolerance to metals, antibiotics, and disinfectants may represent an advantage for their ubiquity and opportunistic pathogenic potential. In this study, we compared five strains that differed on the origin (hospital effluent, tap water, mineral water) and in the susceptibility to aminoglycosides, regarding their tolerance to metals and disinfection. The growth kinetics and biofilm formation capacity were tested in four R. pickettii strains and one R. mannitolilytica at sub-inhibitory concentrations of aminoglycosides or arsenite. The survival to UV radiation, chlorine, or hydrogen peroxide was also compared in aminoglycoside resistant and susceptible strains. Aminoglycoside-resistant strains presented a higher tolerance to arsenite than the susceptible ones and either aminoglycosides or arsenite was observed to stimulate the biofilm formation. Sub-inhibitory concentrations of the aminoglycoside gentamicin or arsenite significantly decreased the growth rate and yield, but only arsenite caused a significant increase of the lag phase. Hydrogen peroxide presented higher disinfection effectiveness against aminoglycoside susceptible than against resistant strains, an effect that was not observed for UV or chlorine. Although this conclusion needs validation based on a larger number of isolates, including clinical, the results suggest that aminoglycoside resistance may be associated with traits that influence Ralstonia spp. fitness in the environment.
- Betaproteobacteria are predominant in drinking water: are there reasons for concern?Publication . Ferro, Pompeyo; Vaz-Moreira, Ivone; Manaia, Célia M.Betaproteobacteria include some of the most abundant and ubiquitous bacterial genera that can be found in drinking water, including mineral water. The combination of physiology and ecology traits place some Betaproteobacteria in the list of potential, yet sometimes neglected, opportunistic pathogens that can be transmitted by water or aqueous solutions. Indeed, some drinking water Betaproteobacteria with intrinsic and sometimes acquired antibiotic resistance, harbouring virulence factors and often found in biofilm structures, can persist after water disinfection and reach the consumer. This literature review summarises and discusses the current knowledge about the occurrence and implications of Betaproteobacteria in drinking water. Although the sparse knowledge on the ecology and physiology of Betaproteobacteria thriving in tap or bottled natural mineral/spring drinking water (DW) is an evidence of this review, it is demonstrated that DW holds a high diversity of Betaproteobacteria, whose presence may not be innocuous. Frequently belonging to genera also found in humans, DW Betaproteobacteria are ubiquitous in different habitats, have the potential to resist antibiotics either due to intrinsic or acquired mechanisms, and hold different virulence factors. The combination of these factors places DW Betaproteobacteria in the list of candidates of emerging opportunistic pathogens. Improved bacterial identification of clinical isolates associated with opportunistic infections and additional genomic and physiological studies may contribute to elucidate the potential impact of these bacteria.