Habibovic, PamelaBarata, DavidDias, Paulo Jorge Mesquita Queirós Castro2016-05-162016-01-262015http://hdl.handle.net/10400.14/20121Substratos com topografias artificiais têm demonstrado serem capazes de influenciar o comportamento celular. No entanto, dependendo da aplicação pretendida, a sua fabricação pode ser complexa. De modo a ultrapassar as limitações de tecnologias convencionais, utilizou-se um processo de fotolitografia, capaz de criar objetos 3D a uma escala nanométrica, baseada no conceito de fotopolimerização induzida pela absorção simultânea de dois fotões (TPP-Two Photon Polymerization). A fase inicial do projeto caracterizou-se pelo desenvolvimento das competências técnicas necessárias. No decorrer do processo de aprendizagem, foram também avaliadas algumas das limitações do sistema, nomeadamente longos tempos de fabrico. De modo a contornar a situação, demonstrou-se a possibilidade de replicar objetos, previamente fabricados por TPP, em polistireno (PS) e ácido poliláctico (PLA), usando para tal um elastómero para criar moldes que permitem produção em massa. Após uma série de otimizações e alterações de design, vários padrões com características, micro (vigas) e nanométricas (traços) assim como topografias baseadas em pilares cilíndricos com diferentes alturas (uniforme: 5μm, 13μm; variável: 3 a 15μm) foram desenvolvidos e replicadas em PS de modo a avaliar o seu efeito na forma e orientação de uma linhagem celular pré-osteoblástica, MG-63. Os resultados dos substratos com pilares sugerem a existência de um valor limite a partir do qual o tamanho dos pilares induz o alinhamento celular e mudança de forma. Células expandidas durante 72 horas só mostram alterações morfologias em superfícies com estruturas superiores a 6μm tendo adquirido uma forma alongada e orientando-se preenchendo os espaços entre pilares. O padrão das vigas e traços visou avaliar o efeito simultâneo de duas topografias com escalas distintas numa só amostra. A sua análise após 72 horas mostrou uma clara influência das estruturas micrométricas (vigas) e ausência de efeito por parte traços, promovendo o alinhamento celular numa direção paralela às estruturas assim como tendência a formar uma conformação tipo tecido entre as vigas. Como trabalho futuro foram sugeridas outras possíveis aplicações, nomeadamente a nível de análise de células individuais e estudos de invasão celular. Por fim, testaram-se para uso em TPP, diversas composições de um biopolímero baseado em PLA que teve como resultados mais positivos uma formulação de PLA/NVP (N-vinilpirrolidona) usando 5%Wt. de um fotoiniciador derivado de benzofenona.Patterned surfaces have been shown to be capable of influencing cellular behaviour. However, depending on the intended application their assembly may be a complex process. To overcome the limitations of common fabrication processes, a laser lithography technique based on the two-photon absorption effect, was used to construct several micro and nanostructures. Initial stages of the project were devoted to developing the technical skills and assessing the limitations of the two photon polymerization (TPP) fabrication process. It was additionally shown, the possibility of mass producing TPP constructs by replicating them, via soft lithography, in polystyrene (PS) and polylactic acid (PLA) imprints, without losing the original geometry. Following a series of optimizations and design alterations, two classes of patterned surfaces were fabricated, replicated in PS and seeded with a pre-osteoblastic stem cell lineage, MG-63, for 72 hours. The first class, was developed to explore the effect of micro (beams) and nano (dashes) structures within the same sample. The 72 hour timepoint analysis has shown a significant influence of the micrometric structures (beams), as opposed to the dashes, in inducing cell orientation and migration following a direction parallel to the beams as well as a tendency to form a tissue like conformation in the spaces between beams. The second class of patterns included two uniform cylinder based pillar topographies, with different heights (low: 5μm and high: 13μm) and a ramp-like structure with variable pillar height (3 to 15μm). Contrary to cells expanded in the smaller pillars, both the high and variable height patterns promoted an elongated shape, with cells orientated across the pillar spaces. The height gradient created by the variable pillars, suggested the existence of a height threshold capable of inducing morphological change, since only cells within the patterned region where pillar height is greater than 6μm, exhibit similar behaviour to the high pillars topography. As future work, it was also suggested that this fabrication technique may find wide application in single cell analysis and migration studies. Lastly, several custom PLA-based biopolymers were developed\optimized, for two photon fabrication. The best formulation was obtained for a 50/50 ratio of a PLA\NVP (N-vinylpyrrolidone) monomer mixture and 5%Wt. of a Benzophenone derivative photoinitiator.engmaster thesis201465124