Mesquita, Raquel Beatriz Ribeiro deRangel, Antonio Osmaro Santos SilvaFerreira, Francisca Teixeira Soares da Mota2025-06-232025-06-232025-05-232025-02http://hdl.handle.net/10400.14/53723Ensuring basic healthcare access around the world remains a challenge, particularly in lowincome regions. In response, international initiatives such as the Sustainable Development Goals (SDGs) and the World Health Organization (WHO) guidelines emphasize the need to develop innovative, accessible, and cost-effective diagnostic tools. Point-of-care testing has emerged as an ideal solution, enabling rapid and decentralized analysis. Among these type of devices, microfluidic paper-based analytical devices (µPADs) have gained attention due to their affordability, portability, and ease of use, making them a particularly valuable tool in resource-limited locations. The purpose of the work presented throughout this thesis was to design and develop innovative point-of-care methodologies based on the µPAD approach for the determination of several healthrelated parameters, that could serve as an adding tool in the diagnosis and monitoring of several health conditions. The use of biological samples of non-invasive collection, such as saliva and urine, enhances diagnostic accessibility, particularly in point-of-care settings where traditional sample collection may be impractical or even impossible. Additionally, this thesis also explores the use of colorimetric detection methods, a straightforward approach to quantifying the targeted analytes by producing visible colour changes. To further improve the specificity and accuracy of these diagnostic tools, enzymatic reactions were incorporated into some of the developed µPADs. The first developed device was dedicated to the quantification of total iron in urine samples by using the colorimetric reaction of bathophenanthroline with iron (II) coupled with hydroxylamine, a well-known reducing agent capable of converting iron (III) in iron (II). To handle the potential colour of the urine samples, a sample blank was included in the device. This feature was vital to ensure the applicability of the developed μPAD, as urine may present a wide variability of colour range, from light yellow to brownish. The determination of nitrate was also accomplished in urine samples with a newly developed µPAD. This device included the enzymatic reaction of nitrate reductase to perform the conversion of nitrate to nitrite and the Griess reagent which provided the colorimetric detection of the resulting nitrite. In order to delay the vertical flow and increase the extent of the enzymatic reaction, a hydrophilic membrane layer was also incorporated into the device. The small porosity of this membrane also led to the retention of the compound responsible for the colour of urine, enabling a direct analysis of the samples. The next devices developed performed the quantification of NHX and urea in saliva samples but with a more complex approach. Not only were the devices composed of four layers, but the detection relies on the diffusion of NH3 (g) through a gas-diffusion membrane to produce a colorimetric change of a pH indicator. The hydrophobicity of this membrane also helped eliminate possible interferences of the saliva sample in the colorimetric reaction, since it did not allow the sample to pass through the membrane and reach the colour reagent. The urea determination was accomplished by including urease in the device, since it selectively catalyzes the dissociation of urea in ammonia and carbon dioxide. The urease activity determination was accomplished using a similar structure and reactions to the one used for the urea µPAD. However, the determination itself was achieved using the kinetic capabilities of the enzyme by correlating to the urease activity with the variation of the signal obtained between two different enzymatic reaction times. This strategy not only allowed a more accurate quantification but also suppressed the influence of NHX already present in the samples. The last device developed using the µPAD structure approach was to quantify glucose in saliva samples. With only two layers in its composition, this device uses a combination of two enzymatic reactions. First, glucose oxidase converts glucose into gluconic acid and hydrogen peroxide, then followed by the release of oxygen from hydrogen peroxide performed by peroxidase. The colorimetric detection is accomplished with the oxidation of o-dianisidine. In this work, a correlation between the concentration of glucose in saliva and blood was also successfully established, using #5 saliva samples of diabetic patients and the correspondent glucometer measurements provided by the patients. A rather different approach was used to perform the semi-quantitative analysis of E. coli DNA. Instead of developing a µPAD, an option was made to design a barcode-style lateral flow strip that would allow the semi-quantitative detection of E. coli. The amplification of the DNA in the sample was performed using the Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) technique since it can be performed at a constant temperature and provides high sensitivity and specificity results. The developed methodology, although requiring further optimization, showed reliable performance and offers a rapid, cost-effective method for E. coli detection. Overall, this thesis demonstrates the potential of microfluidic paper-based analytical devices and lateral flow assays as innovative, cost-effective diagnostic tools for point-of-care applications. By addressing critical challenges such as sample complexity, reagent stability, and measurement accuracy, the developed devices enhance accessibility to reliable testing, particularly in resourcelimited settings. Their affordability and ease of use further emphasize their role in expanding diagnostic capabilities outside traditional laboratory environment.Garantir o acesso a cuidados básicos de saúde em todo o mundo continua um desafio, especialmente em regiões com baixos rendimentos. Em resposta, iniciativas internacionais como os Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODS) e as diretrizes da Organização Mundial da Saúde (OMS) enfatizam a necessidade de desenvolver metodologias de diagnóstico inovadoras, acessíveis e económicas. Os testes “point-of-care” surgiram como uma solução ideal, permitindo análises rápidas e realizadas fora do laboratório. Entre este tipo de testes, os dispositivos analíticos microfluídicos baseados em papel (µPADs) têm ganho atenção devido à sua acessibilidade, portabilidade e facilidade de uso, tornando-os uma ferramenta particularmente valiosa em locais em que os recursos são limitados. O objetivo do trabalho apresentado ao longo desta tese foi delinear e desenvolver metodologias inovadoras “point-of-care” com base na metodologia dos µPADs para a determinação de vários parâmetros importantes para a saúde, que podem servir como uma ferramenta adicional no diagnóstico e monitorização de várias doenças. O uso de amostras biológicas de colheita não invasiva, como saliva e urina, aumenta a acessibilidade diagnóstica, especialmente em ambientes de ponto de atendimento onde a coleta tradicional de amostras pode ser impraticável ou mesmo impossível. Além disso, esta tese também explora o uso de métodos de deteção colorimétrica, uma abordagem direta para quantificar os analitos produzindo mudanças de cor visíveis. Para melhorar ainda mais a especificidade e a precisão dessas ferramentas de diagnóstico, reações enzimáticas foram incorporadas em alguns dos µPADs desenvolvidos. O primeiro dispositivo desenvolvido foi dedicado à quantificação de ferro total em amostras de urina usando a reação colorimétrica da batofenantrolina com ferro (II) juntamente com hidroxilamina, um conhecido agente redutor capaz de converter ferro (III) em ferro (II). Para lidar com a cor das amostras de urina, um branco de amostra foi incluído no dispositivo. Esta estratégia foi vital para garantir a aplicabilidade do μPAD desenvolvido, pois a urina pode apresentar uma ampla variabilidade de cor, de amarelo claro a acastanhado. A determinação de nitrato também foi realizada em amostras de urina com um µPAD desenvolvido. Este dispositivo incluiu a reação enzimática da nitrato redutase para realizar a conversão de nitrato em nitrito, e o reagente de Griess que permitiu a deteção colorimétrica do nitrito resultante. Para atrasar o fluxo vertical e aumentar a extensão da reação enzimática, uma camada de membrana hidrofílica também foi incorporada no dispositivo. A baixa porosidade desta membrana também permitiu a retenção dos compostos responsáveis cor à urina, permitindo asimm uma análise direta das amostras. Os seguintes dispositivos desenvolvidos efetuaram a quantificação de NHX e ureia em amostras de saliva, mas com uma abordagem mais complexa. Além dos dispositivos serem compostos de 4 camadas, a deteção depende da difusão de NH3 (g) através de uma membrana de difusão de gás para produzir uma mudança colorimétrica do indicador de pH. A hidrofobicidade desta membrana também ajudou a eliminar possíveis interferências da amostra de saliva na reação colorimétrica, uma vez que não permitiu que a amostra passasse através da membrana e atingisse o reagente de cor. A determinação da ureia foi conseguida incluindo urease no dispositivo, uma vez que catalisa seletivamente a dissociação da ureia em amoníaco e dióxido de carbono. A determinação da atividade da urease foi realizada usando uma estrutura e reações semelhantes às usadas para o µPAD da ureia, no entanto, a determinação em si foi realizada usando as capacidades cinéticas da enzima, estabelecendo uma relação entre a atividade da urease e a variação do sinal obtido entre dois tempos de reação enzimática diferentes. Essa estratégia não só permitiu uma quantificação mais precisa, mas também suprimiu a influência do NHX já presente nas amostras. O último dispositivo desenvolvido usando a abordagem de µPAD foi para quantificar glucose em amostras de saliva. Com apenas duas camadas na sua composição, este dispositivo usa uma combinação de duas reações enzimáticas. Primeiro, a glucose oxidase converte glucose em ácido glucônico e peróxido de hidrogênio, seguido pela liberação de oxigênio do peróxido de hidrogênio realizada pela peroxidase. A deteção colorimétrica é realizada com a oxidação de o-dianisidina. Neste trabalho, uma correlação entre a concentração de glucose na saliva e no sangue também foi estabelecida com sucesso, usando #5 amostras de saliva de pacientes diabéticos e as correspondentes medições do glicosímetro fornecidas pelos pacientes. Foi usada uma abordagem bastante diferente para realizar a análise semi-quantitativa do DNA de E. coli. Em vez de desenvolver um µPAD, optou-se por desenvolver uma tira de fluxo lateral em estilo de código de barras que permitisse a deteção semi-quantitativa de E. coli. A amplificação do DNA na amostra foi realizada usando a técnica de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP), pois pode ser realizada a uma temperatura constante e produz resultados de alta sensibilidade e especificidade. A metodologia desenvolvida, embora necessite de maior otimização, mostrou um bom desempenho e podendo ser considerado como um método rápido e económico para deteção de E. coli. No geral, esta tese demonstra o potencial tanto de dispositivos analíticos baseados em papel como de testes de fluxo lateral, como ferramentas de diagnóstico inovadoras e económicas para aplicações point-of-care. Ao encarar desafios críticos como complexidade da amostra, estabilidade dos reagentes e precisão da medição, os dispositivos desenvolvidos aumentam a acessibilidade a testes de confiança, especialmente em zonas com recursos limitados. Sua acessibilidade e facilidade de uso enfatizam ainda mais seu papel na expansão das capacidades de diagnóstico fora dos ambientes laboratoriais tradicionais.engMicrofluidic analytical toolsColorimetric detectionPoint-of-care analysisSaliva and urine samplesFerramentas analíticas de microfluxoDeteção colorimétricaAnálise point-of-careAmostras de saliva e urinadoctoral thesis101807180