Farrell, PaulCosta, Inês Maria de Carvalho2021-06-212021-06-212017-04-272016http://hdl.handle.net/10400.14/33762Epstein-Barr virus (EBV) is a large, ubiquitous human γ-herpesvirus. Infection of primary resting B lymphocytes with EBV forms proliferating lymphoblastoid cell lines (LCL). EBV nuclear antigens (EBNA) EBNA2, EBNA3A and 3C are required for efficient transformation of B lymphocytes. EBNA2 acts as a transcriptional activator of viral and cellular genes that cause cell proliferation by acting as an adapter molecule that binds to DNA-binding proteins. The best known of these cell proteins is RBP-Jκ, although other binding sites have also been proved to mediate EBNA2 functions. The superior B cell transformation ability of Type 1 (T1) EBV, in comparison to Type 2 (T2) EBV, is due to greater or more rapid induction of a small group of cell and viral genes. It appears that EBNA2 binds to sites near these genes by a different mechanism from the usual process, which involves PU.1 and IRF transcription factors and is not dependent on the usual mechanism involving cell protein RBP-Jκ. BS69 cell protein is a transcriptional repressor. It interacts with adenovirus E1A and EBNA2 through its MYND domain which recognizes a PXLXP peptide motif present in EBNA2. EBNA3A and EBNA3C in Type 1 EBV also have the same motif. The aims of this study were to create a system to identify the non RBPJ EBNA2 binding sites in cell genes using a lymphoma cell line lacking RBPJ gene (SM224.9 cells) and to test binding of Type 1 EBNA3A and EBNA3C fragments to BS69 by in vitro translation and pull-down assay to determine if there are any differences in BS69 binding to each. Overall, DG75 and SM224.9 cells EBNA2 expression was successful, although it was not possible to determine which cell genes EBNA2 can activate without using RBP-Jκ. The results are consistent through all the pull-down assays repeated, with the T1 EBNA3A and 3C having a distinct binding to BS69. It is noticeable there is a stronger binding of T1 EBNA3C to BS69. T1 EBNA3A is able to bind better to BS69 when comparing to the T2 EBNA3A and EBNA3C. In all the assays there is some unspecific binding to Rab11b, used as a negative control. The pull-down assays were repeated various times in order to achieve better conditions, adjusting the incubation times with the IVT product and changing the buffer washes, to try to reduce the non-specific binding (both to GST-Rab11b and the beads). Changing the conditions did not significantly reduce the unspecific binding, either to Rab11b or the beads.O vírus Epstein-Barr (EBV) é um vírus humano da família Herpesviridae. A infecção de linfócitos B com EBV forma linhas celulares linfoblastóides (LCL), os antígenos nucleares EBNA2, EBNA3A e 3C são necessários para a transformação eficiente de linfócitos B. O EBNA2 actua como um activador transcricional de genes virais e celulares, que causam proliferação celular, actuando como uma molécula adaptadora que se liga às proteínas de ligação do DNA. A mais conhecida destas proteínas é a RBP-Jκ, embora se tenha provado que outros sítios de ligação medeiam as funções de EBNA2. A capacidade superior de transformação de células B do EBV de Tipo 1 (T1), em comparação com o EBV de Tipo 2 (T2), deve-se à maior ou mais rápida indução de um pequeno grupo de genes celulares e virais. Os resultados indicam que EBNA2 se liga a locais próximos destes genes por um mecanismo diferente do processo usual, que envolve os factores de transcrição PU.1 e IRF e não depende do mecanismo habitual envolvendo a proteína celular RBP-Jκ. A proteína BS69, um repressor transcricional, interage com EBNA2 através do seu domínio MYND, que reconhece o motif péptido PXLXP presente em EBNA2. EBNA3A e EBNA3C do EBV Tipo 1 também têm o mesmo motif. Os objectivos deste estudo foram: criar um sistema para identificar os locais de ligação (não RBP-Jκ) de EBNA2 utilizando uma linha celular de Linfoma de Burkitt sem o gene RBPJ (células SM224.9), e testar a ligação de fragmentos de EBNA3A e EBNA3C do Tipo 1 a BS69 através de translação In vitro e ensaio pull-down para determinar se existem diferenças na ligação de cada um à proteína BS69. Foi possível comprovar a expressão de EBNA2 nas células DG75 e SM224.9, embora não tenha sido possível determinar quais os genes que EBNA2 pode activar sem utilizar RBP-Jκ. Os resultados são consistentes em todos os ensaios pull-down repetidos, com o EBNA3A e 3C de T1 possuindo uma ligação distinta à proteína BS69. É notável que há uma ligação mais forte de T1 EBNA3C a BS69. T1 EBNA3A é capaz de se ligar melhor a BS69 quando comparado com o T2 EBNA3A e EBNA3C. Em todos os ensaios foi possível observar algumas ligações não específicas a Rab11b, utilizada como controlo negativo. Os ensaios pull-down foram repetidos várias vezes para se obterem melhores condições de ligação, ajustando os tempos de incubação com o produto de IVT e mudando as condições de lavagem, no intuito de tentar reduzir a ligação não específica (tanto para GST-Rab11b como para as esferas). A alteração das condições não reduziu significativamente a ligação inespecífica, quer a Rab11b quer às esferas.engmaster thesis201957965