Castro, Paula Maria LimaAfonso, CarlosCarvalho, FátimaMoreira, Irina Susana Sousa2013-01-312013-01-312012-08-01http://hdl.handle.net/10400.14/10120Environmental contamination with toxic chemicals of human origin is a threat to ecosystems and public health. Thus, it is extremely important to understand and explore the removal of these contaminants from different environments through biodegradation. The main objective of the work described in this thesis was the exploitation of the potential of Labrys portucalensis F11 – a bacterial strain previously isolated by its ability to degrade fluorobenzene (FB) - for biotransformation of fluorinated aromatic compounds of different complexity. Typically, contaminated environments are not contaminated with a single pollutant but with mixtures of pollutants. In particular the presence of organic compounds and metals in the same ecosystem, or appearing simultaneously in wastewater streams, is very common. In this study, the effect of three metals with different biological importance - iron, copper and silver - on the degradation of FB by strain F11 was evaluated. At a concentration of 1 mM, iron proved to be beneficial for bacterial growth without adversely affecting the biodegradation of up to 2 mM of FB. The presence of 1 mM of copper and silver inhibited the degradation of FB and led to the accumulation of intermediate metabolites, catechol and 4-fluorocatecol suggesting inhibition of the catechol 1,2-dioxygenase, which is a key enzyme of the metabolic pathway of FB. The degradation of compounds with chemical structures similar to FB, namely chlorobenzene (CB) and difluorobenzenes (DFBS), by L. portucalensis was investigated. Strain F11 was able to cometabolise CB in the presence of FB or when previously induced by this compound. Total degradation of 0.5 mM of each substrate was observed when both were added to the culture medium. Strain F11 was capable of degrading CB when the expression of enzymes is induced by FB however CB was not able to induce the enzymes for its own degradation. For DFBS, strain F11 proved to be able to degrade 0.5 mM of 1,3-DFB as sole carbon source, and to degrade 1,4-DFB (0.5 mM) in cometabolism with FB (0.5 mM). Strain F11 was unable to degrade 1,2-DFB and this compound inhibited the degradation of FB. These results reinforce the importance of the nature, number and position of the substituents in the molecule for enzyme expression and subsequently conversion of the target compounds. Fluoxetine (FLX) is a fluorinated chiral drug, which contamination, toxicity and persistence in the environment have been well documented in the past years. L. portucalensis F11 showed to be able to degrade both enantiomers of this compound as the sole carbon source (up to 9 μM) and in the presence of a conventional carbon source, sodium acetate (up to 89 μM of FLX). Degradation extents of at least 80% of total FLX were obtained. At the lowest FLX concentration tested (2 μM) as single carbon source, degradation was complete and fluoride release was stoichiometric. The degradation was shown to be enantioselective, with preferential degradation of R-FLX in relation to S-FLX. The transient formation of norfluoxetine (NFLX) as an intermediary metabolite was detected. With the objective of finding the genes responsible for the expression of FB dioxygenase, a genomic library consisting of 960 clones was constructed from the DNA of L. portucalensis F11. This library can be used for future work, such as the generation and confirmation of sequencing data, for comparative genomic studies or to search for other genes of interest. It is important to note that this strain has shown extraordinary capabilities of degradation of toxic compounds, and as such it would be very interesting to further study the genes that confer these capabilities. A partial nucleotide sequence of the gene cluster involved in FB degradation was determined. Sequencing results revealed the presence of four open reading frames, namely the gene coding for 1,2-catechol dioxygenase, and three genes encoding a ringhydroxylating dioxygenase (alpha and beta subunit of the dioxygenase component and the oxidoreductase component). Alignment of the deduced aminoacid sequences with sequences of others ring-hydoxylating dioxygenases revealed a high degree of similarity (≥80% identity) to the components of (halo)benzoate dioxygenases. The conserved amino acid residues that are involved in cofactor binding were also identified in the protein sequence. Recombinant strains carrying the putative FB dioxygenase genes were tested for expression. The SDS-PAGE analysis revealed that most of the expressed protein was on the pellet fraction and not on the soluble form, which could be due to improper folding of the enzyme components. Decrease of substrate concentration was observed in bioconversion experiments but the product formed was not detected/ identify. Overall, strain F11 revealed to be capable of degrading a vast range of fluorinated compounds with different complexity and as such can be a potential strain to devise biotechnological solutions for biotransformation processes.A contaminação do ambiente com produtos químicos de origem humana constitui uma ameaça para os ecossistemas e para a saúde pública. Deste modo, é extremamente importante compreender e explorar a sua biodegradação. O trabalho descrito nesta tese teve como objectivo principal a investigação do potencial da estirpe Labrys portucalensis F11 - uma bactéria anteriormente isolada pela sua capacidade de degradar fluorobenzeno (FB) - para a biotransformação de compostos aromáticos fluorados de diferente complexidade. Tipicamente, a contaminação do ambiente resulta da presença de uma mistura de poluentes e não apenas da presença de um único contaminante. Deste modo, a coexistência de compostos orgânicos e metais no mesmo ecossistema, ou em águas residuais, é muito comum. Neste estudo foi avaliado o efeito de 3 metais – cobre, ferro e prata, com diferente importância biológica na degradação do FB. Na concentração de 1 mM, o ferro foi benéfico para o crescimento bacteriano sem afectar adversamente a biodegradação de FB até à concentração de 2 mM. Na presença de 1 mM de cobre e de prata verificou-se a inibição da degradação do FB levando à acumulação de dois metabolitos intermediários, o catecol e o 4-fluorocatecol, sugerindo a inibição da catecol 1,2-dioxigenase, uma enzima chave da via metabólica do FB. A degradação de compostos com estruturas químicas semelhantes à do FB, clorobenzeno (CB) e difluorobenzenos (DFBS), foi avaliada. A estirpe F11 foi capaz de cometabolizar o CB na presença do FB, com degradação total de 0,5 mM de cada um dos substratos quando adicionados simultaneamente ou quando previamente induzida pelo FB. No entanto, o CB não induziu as enzimas para a sua própria degradação. Em relação aos DFBs, a estirpe F11 foi eficaz na degradação de 0,5 mM de 1,3-DFB como única fonte de carbono, e na degradação de 1,4-DFB (0,5 mM) em cometabolismo com FB (0,5 mM). No entanto, a estirpe F11 foi ineficaz na degradação do 1,2-DFB, tendo este composto inibido a degradação de FB. Estes resultados reforçam a importância da natureza, número e posição dos substituintes na molécula para a expressão enzimática e consequente conversão de compostos alvo. A fluoxetina (FLX) é um fármaco quiral fluorado, cuja toxicidade, contaminação e persistência no ambiente têm sido bem documentadas. A estirpe F11 mostrou ser capaz de degradar os dois enantiómeros deste composto como única fonte de carbono (até 9 μM) e na presença de acetato de sódio (até 89 mM de FLX). Foram obtidas extensões de degradação de pelo menos 80% de FLX total. Na concentração mais baixa de FLX (2 μM), testada como única fonte de carbono, a degradação foi completa e a libertação de fluoreto foi estequiométrica. A degradação revelou ser enantiosselectiva, com a degradação preferencial de R-FLX em relação a S-FLX, tendo sido detectada a formação de norfluoxetina (NFLX) como metabolito intermediário. Com o objectivo de pesquisar os genes responsáveis pela expressão da FB dioxigenase, foi construída uma biblioteca genómica, constituída por 960 clones, a partir do DNA da estirpe F11 de L. portucalensis. Esta biblioteca poderá ser usada em trabalhos futuros, como a geração e confirmação dos dados da sequenciação, em estudos de genómica comparativa ou na pesquisa de outros genes de interesse. É importante realçar que a estirpe F11 tem demostrado uma capacidade extraordinária na degradação de compostos tóxicos, sendo deste modo, de grande interesse estudar os genes que lhe conferem estas capacidades. Foi determinada uma sequência parcial dos nucleótidos do operão envolvido na degradação do FB. A sequenciação mostrou a existência de 4 genes, nomeadamente, o gene que codifica a 1,2-catecol dioxigenase, e os 3 genes que codificam as 3 subunidades da FB dioxigenase (alfa e beta da componente dioxigenase e oxidoreductase). O alinhamento das sequências de aminoácidos obtidas com as sequências de outras dioxigenases aromáticas revelou um elevado grau de similaridade (≥80%) com os componentes das (halo)benzoato dioxigenases. A sequenciação também permitiu identificar resíduos de aminoácidos conservados que estão envolvidos na ligação de cofactores. Estirpes recombinantes contendo os genes putativos da FB dioxigenase foram testadas para a expressão da enzima. A análise de SDS-PAGE revelou que a maioria da proteína expressa se encontrava na fracção do pellet e não na fracção solúvel, o que pode estar relacionado com uma conformação incorrecta dos componentes enzimáticos. Nas experiências de bioconversão foi observada diminuição da concentração de substrato mas o produto formado não foi detectado / identificado. Em geral, a estirpe F11 revelou ser capaz de degradar uma vasta gama de compostos fluorados com diferente complexidade e, como tal, pode ser considerada uma estirpe com potencial para aplicação e desenvolvimento de soluções biotecnológicas em processos de biotransformação.engdoctoral thesis101316208