Vaz, Cidalia Irene Azevedo PinaGomes, Maria do Rosário Almeida2021-01-212021-01-212018-12-142018http://hdl.handle.net/10400.14/31713Entre os beta-lactâmicos, os carbapenemos são os antimicrobianos mais eficazes contra bactérias Gram-negativo. O aparecimento de bactérias multirresistentes ameaça seriamente essa classe de fármacos que salvam vidas. A determinação de concentrações mínimas inibitórias (CMI) aos antibióticos é atualmente considerada importante quer para o tratamento destas infeções quer para o controlo epidemiológico. Este estudo propõe um novo teste de suscetibilidade antimicrobiana baseado em citometria de fluxo para determinação rápida da CMI aos carbapenemos diretamente de hemoculturas positivas. Noventa e sete isolados clínicos de bacilos de Gram-negativo e oito estirpes de referência (ATCC), incluindo 36 Enterobacteriaceae, 36 Pseudomonas aeruginosa e 33 Acinetobacter spp., foram estudados. As hemoculturas (BD) foram inoculados com 103 bactérias/frasco e 8 mL de sangue fresco humano de dador saudável, e incubadas até positivarem. As células foram recuperadas do sangue de acordo com um protocolo previamente otimizado, incubadas durante 1 h a 37 °C, com concentrações variando entre 1 e 8 μg/mL de imipenem (IMI) e 1 e 8 μg/mL de meropenemo (MRP), e um corante fluorescente indicador do potencial de membrana celular. As células foram analisadas num citómetro de fluxo BD Accuri™C6 Plus. Para cada concentração foi calculado um índice de fluorescência (SI), que é tanto maior quanto maior for a lesão celular, e a menor concentração de fármaco que levou ao aumento da fluorescência (CFM: menor concentração do fármaco que produz um aumento do SI) foi estimada. A associação entre valores de CMI e dados citometricos foi realizada usando um modelo linear geral multivariado. O modelo estatístico estimou os valores de corte e o respetivo intervalo de confiança para a avaliação da CFM para meropenem e imipenem. A análise dos dados mostrou uma associação significativa entre a CMI dos valores de MRP e IMI e CFM com uma elevada concordância (93,06% e 96,70%). A menor concentração de fármaco que causou aumento da fluorescência, determinada por citometria de fluxo, é uma excelente abordagem para calcular os valores de CMI para carbapenemos, mostrando uma alta concordância com a metodologia clássica. Este valor foi obtido em cerca de 2 horas o que, comparando com o método padrão que demora 48h, se traduz num significativo progresso.Among the beta-lactams, carbapenems are the most effective drugs against gram-negative bacteria. The emergence of multidrug-resistant pathogens seriously threatens this class of lifesaving drugs. Minimal inhibitory concentrations (MIC) is an important measure for infection treatment and epidemiological control. This study proposes a novel antimicrobial susceptibility testing based on flow cytometry for MIC determination to carbapenems directly from positive blood cultures. Ninety-seven gram-negative bacilli clinical isolates and eight reference strains (ATCC), including 36 Enterobacteriaceae, 36 Pseudomonas aeruginosa, and 33 Acinetobacter spp., were studied. Aerobic BD blood cultures bottles were spiked with 103 bacteria/bottle and 8 mL of healthy fresh human blood, and incubated until a positive flag. Cells were recovered from the blood according to a previously optimized protocol and incubated during 1h at 37°C, with concentrations ranging between 1 and 8 μg/mL of imipenem (IMI) and 1 and 8 μg/mL of meropenem (MRP), and a membrane potential fluorescent dye. Cells were analyzed in a BD Accuri™C6 Plus Flow Cytometer. For each concentration a staining index (SI) was calculated, which is greater the more significant the cell injury, and a lower antimicrobial concentration leading to increased fluorescence (MFC: less concentration of the drug that produces an increase of the SI) was estimated. The association between MIC values and flow cytometric data was performed using a multivariate general linear model. Statistical model estimated the cutoff values and the respective confidence interval for the evaluation of the MFC for meropenem and imipenem. Data analysis showed a significant association between MIC of MRP and IMI and MFC values with a high essential agreement (93.06% and 96.70%). Lower antimicrobial concentration leading to increased fluorescence, determined by flow cytometry, is an excellent approach to calculate the MIC values for carbapenems, showing a high agreement with classic methodology. This value was obtained in about 2h which, when compared with the standard method that takes 48h, translates into a significant progress.porCitometria de fluxoCarbapenemosTeste de suscetibilidade antimicrobianaConcentração mínima inibitóriaBacilos de gram negativoFlow cytometryCarbapenemsAntimicrobial susceptibility testingMinimum inhibitory concentrationGram negative bacillimaster thesis202469042