Coroadinha, Ana SofiaCosta, Diogo Lima de Vilhena Magalhães2015-01-072017-09-042014-11-142014http://hdl.handle.net/10400.14/16121Background: Gene therapy consists on medical treatment that aims to modulate an individual’s gene expression. To this end, many different gene transfer vehicles called vectors have been developed, including virus derived vectors. Showing promising characteristics, lentiviral vectors still have problems associated to them, especially in their production process, limited by low titers. To increase viral vector titer and producer cell growth, oncogenes such as SV40 Large T (T-Ag) antigen are expressed in producer cell lines, which decrease the safety of the vector preparations. Objectives: With the objective to find alternative cell substrates to HEK293T suitable for high titer vector production, three non-human cell lines were transformed with T-Ag oncogene and transfected with a lentiviral construct. Their vector production and transfection efficiency was characterized. The strength of several promoters to drive the expression of viral components was also evaluated in these cell lines. Results and conclusions: CAG and CMV revealed to be the most promising, although CAG delivers lower titers. In this work, it was shown that Age1.CR and Vero cell lines have the potential to deliver enhanced lentivector titers when expressing T-Ag, which conferred higher transfection efficiencies. Also, HEK293 cells expressing T-Ag were compared to their parental cell line in terms of cell growth and glycolysis in an attempt to understand cellular alterations induced by the oncogene. The results herein obtained will contribute to the development of stable lentivector producer cell lines and for the further understanding of the T-Ag’s influence in virus production.Contexto: A terapia génica consiste num tratamento médico que visa a modulação da expressão génica de um individuo. Com este fim, foram desenvolvidos diversos veículos de transferência de genes, denominados vectores. Estes incluem os vectores derivados de vírus. Apresentando características promissoras, os vectores lentivirais ainda têm problemas a si associados, especialmente no processo de produção, que é limitado pelos baixos títulos obtidos. Para aumentar os títulos de vectores virais e o crescimento das células produtoras, estas expressam oncogenes, tais como o Large T antigen (T-Ag) do SV40, a custo de preparações do vector menos seguras. Objectivos: Com o objectivo de encontrar linhas celulares alternativas às HEK293T adequadas à produção de elevados títulos de vectores virais, três linhas celulares não humanas foram transformadas com o oncogene T-Ag e transfectadas com uma construção lentiviral. A produção do vector e eficiência de transfecção foram caracterizadas. Também foi avaliada a força de vários promotores para a expressão dos componentes virais nestas células. Resultados e conclusões: O CAG e o CMV foram os mais promissores, mas com o CAG obtiveram-se títulos mais baixos. Neste trabalho, foi observado que as linhas celulares Age1.CR e Vero têm potencial para produzir títulos de vectores superiores quando expressam o T-Ag, o que pode estar ligado a maiores eficiências de transfecção. Para além disso, células HEK293 que expressam o T-Ag foram comparadas à sua linha parental em termos de crescimento celular e glicólise, tentando compreender melhor as alterações induzidas pelo oncogene. Os resultados obtidos neste trabalho vão contribuir para o desenvolvimento de linhas celulares estáveis para produção de vectores lentivirais, e para o aumento da compreensão da influência do T-Ag na produção viral.engGene therapyLarge T antigenLentivirusRetrovirusCell lineLinha celularTerapia génicamaster thesis203184793