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Título: Estabelecimento de protocolos de diagnóstico de agentes microbianos associados à periodontife
Autor: Bessa, Ana Bárbara da Silva
Orientador: Correira, Maria José
Palavras-chave: Doença periodontal
Diagnóstico microbiológico
PCR
Biofilme oral
Periodontal disease
Microbiological diagnosis
PCR
Oral biofilm
Data de Defesa: Set-2011
Resumo: As doenças periodontais crónicas são das patologias infecciosas de etiologia bacteriana mais prevalentes por toda a humanidade, causadas essencialmente por bactérias patogénicas que crescem em biofilme. A identificação de microrganismos específicos como o Aggregatibacter actinomycetemcomitans e a Porphyromonas gingivalis, pode contribuir para a determinação do risco de desenvolver doença periodontal e ainda conhecer o comportamento da microflora após terapia periodontal. O presente trabalho tem como objectivo verificar a exequibilidade da realização de um exame de diagnóstico adicional nos laboratórios da UCP. Esse exame consiste na análise microbiológica da presença de 2 agentes microbianos associados à periodontite. Fez-se a avaliação de procedimentos de colheita da amostra, procedimento de extracção inicial de ADN, procedimentos de reacção de PCR, avaliação da satisfação dos solicitantes das análises relativamente aos procedimentos de recolha e utilização dos resultados no diagnóstico periodontal. Foi elaborado um protocolo de diagnóstico de agentes microbianos associados à periodontite, que englobou várias fases desde a elaboração da folha de requisição, protocolo de colheita, protocolo de extracção de ADN e protocolo de PCR específico para cada microrganismo. Foram colhidas e analisadas 59 amostras em 20 pacientes por 17 operadores na consulta de Periodontologia do MIMD da UCP. Os operadores que participaram na recolha destas amostras, preencheram um questionário que permitiu analisar globalmente o protocolo fornecido e a sua utilidade na óptica da comunidade académica da CDU. Não se conseguiu comprovar a exequibilidade do protocolo nos laboratórios da UCP uma vez que todas as amostras se revelaram negativas para os 2 microrganismos. Foram considerados alguns factores que poderiam justificar o facto de todas as amostras terem sido negativas, nomeadamente: funcionamento da reacção de PCR (pela inclusão de um controlo positivo em todas as amostras); presença de ADN (pela visualização em gel de agarose de todas as amostras após o processo de extracção); verificação da origem do ADN das amostras (pela aplicação de primers universais bacterianos). Os resultados de cada uma das destas avaliações conduziram a algumas alterações nos procedimentos de recolha das amostras e isolamento do ADN. São apresentadasjustificações para os resultados e sugeridas mais alterações para futuras investigações da presença destes microrganismos em bolsas periodontais
Chronic periodontal diseases are one of the infectious conditions with bacterial etiology more prevalent in all mankind, mainly caused by pathogenic bacteria that grow in biofilms. The identification of specific microorganisms such as Aggregatibacter actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis, can contribute to determine the risk of developing periodontal disease; to know the composition of the biofilm in periodontal health and also understand the behavior of the microflora after periodontal therapy. The present work aims to verify the feasibility of conducting an additional diagnostic exam in the UCP laboratories. This exam consists in the microbiological analysis of the presence of 2 microbial agents associated with periodontitis. The feasibility test of this exam consisted in the evaluation of procedures for sample collection, procedures for initial DNA extraction, PCR reaction procedures for results optimization, evaluation of the analysis requesters satisfaction about the collection procedures and use of results in periodontal diagnosis. To achieve the objectives proposed, a diagnostic protocol of microbial agents associated with periodontitis was developed, which included several stages from the elaboration of the request sheet, collection protocol, DNA protocol extraction and PCR protocol specific for each microorganism. To test the feasibility of the protocols, 59 samples, collected from 20 patients consulting the periodontology MIMD of CPU were analyzed. The operators, who participated in collecting these samples, completed a questionnaire that allowed analyzing globally the protocol provided and its usefulness in terms of the academic community of the CDU. We were unable to prove the feasibility of the protocol in the laboratories of the CPU since all samples proved negative for the two microorganisms. We considered some factors that could justify the fact that all samples were negative including: operation of the PCR reaction (by adding a positive control in all samples), presence of DNA (by agarose gel visualization of all samples after the extraction process), verification of the origin of DNA samples (by applying universal bacterial primers).The results of each of these assessments lead to some changes in the procedures of collecting samples and DNA isolation. Justifications are given for the results and suggested further changes to future investigations of the presence of these microorganisms in periodontal pockets.
URI: http://hdl.handle.net/10400.14/9211
Aparece nas colecções:R - Dissertações de Mestrado / Master Dissertations
DCSV - Dissertações de Mestrado / Master Dissertations

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