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Título: Sequenciação da região C2-V3 do gene ENV do vírus da imunodeficência humana tipo 1 (VIH-1) para determinação do tropismo viral
Autor: Martins, Andreia Rodrigues
Orientador: Gomes, Perpétua
Data de Defesa: Jun-2010
Resumo: A entrada do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (VIH-1), na célula hospedeira, é mediada pela ligação da glicoproteína viral gp120 a um receptor CD4 e, subsequentemente, a um de dois co-receptores de quimiocinas, CCR5 e CXCR4. Desta forma, o tropismo do VIH-1 é definido pelo tipo de co-receptor utilizado para infectar a célula hospedeira: R5 - para estirpes que usam o CCR5, X4 - para estirpes que usam o CXCR4 e R5/X4 - para aquelas que usam ambos os co-receptores. Os antagonistas do CCR5 são uma nova classe de agentes anti-retrovirais que bloqueiam a ligação viral ao co-receptor CCR5. Recentemente, foi aprovado, para uso clínico, o primeiro agente desta classe, denominado Maraviroc. A prescrição do Maraviroc requer a realização de um teste de determinação do tropismo viral, antes do início de um regime terapêutico com este fármaco, uma vez que este só é efectivo contra estirpes R5. Actualmente, a determinação do tropismo é realizada por testes fenotípicos, encontrando-se apenas um clinicamente validado, o Trofile HIV Co-receptor Tropism (Monogram Biosciences, E.U.A). Este teste envolve uma logística complexa e procedimentos de colheita e processamento da amostra de grande precisão, é moroso e dispendioso e encontra-se apenas disponível num laboratório, altamente qualificado, nos Estados Unidos da América (E.U.A). Qualquer falha, nas etapas da colheita, separação do plasma e tempo de congelamento, resulta num teste inválido. Assim, têm sido desenvolvidas metodologias genotípicas, baseadas em sequências do gene env do VIH-1, mais rápidas e económicas do que os testes fenotípicos. Estes métodos baseiam-se no princípio de que a região V3 do gene env do VIH-1 é a maior determinante para a escolha do co-receptor, uma vez que é a região viral responsável pela ligação vírus-co-receptor. Estão disponíveis, na internet, métodos bioinformáticos para determinar o tropismo viral a partir de sequências correspondentes à região V3: WetCat, Position-specific scoring matrices (WebPSSM) e Geno2pheno [coreceptor]. O valor predictivo dos algoritmos existentes continua a melhorar à medida que mais dados genotípicos-fenotípicos se tornam disponíveis, permitindo que a determinação do tropismo viral, através de métodos genotípicos, seja cada vez mais exacta.Aliás, há já países europeus que, nas suas guidelines para o uso deste tipo de testes, na prática clínica, apenas recomendam a execução de um teste genotípico. Os objectivos deste estudo foram: - Validar um teste genotípico para determinação do tropismo viral, com base na sequenciação da região V3, para ser aplicado na prática clínica; - Investigar a evolução do tropismo viral presente na fase de seroconversão e na fase tardia de infecção VIH/SIDA; - Correlacionar o tropismo viral com o subtipo viral. Para isso foram testadas 192 amostras de plasma, de indivíduos seropositivos para VIH-1. Em 119, foi possível amplificar, por nested RT-PCR, um fragmento de 534 pb, correspondendo à região C2-V3 do gene env, o qual foi sequenciado em ambas as cadeias; as sequências nucleotídas resultantes foram submetidas ao algoritmo Geno2pheno para determinação do tropismo viral. A determinação do tropismo viral pelo Geno2pheno revelou, para o total das 119 amostras amplificadas, que 92 (77,3%) eram estirpes virais trópicas para o co-receptor CCR5 e 27 (22,7%) estirpes trópicas para CXCR4. Das 119 amostras, 29 foram testadas, em simultâneo, para validação do teste genotípico Geno2pheno contra o teste fenotípico Trofile. Obteve-se resultado final para 28 (96,5%) amostras através do Geno2pheno e para 23 (79,3%) através do Trofile. Estes testes foram concordantes a preverem o uso do co-receptor em 87% dos casos, utilizando uma taxa de falsos positivos de 10% no Geno2pheno. Obteve-se, desta forma, uma elevada concordância entre o teste genotípico aqui validado e o teste fenotípico validado prospectivamente (Trofile), tendo sido encontrado um maior número de estirpes R5. Ao contrário do que seria de esperar, não se verificou nenhuma associação entre o uso do co-receptor e a fase da infecção VIH/SIDA (seroconversão versus fase tardia), bem como entre o uso do co-receptor e o subtipo viral (subtipos B versus C), provavelmente, devido ao facto de o número de amostras estudadas ser reduzido. Estes resultados enfatizam a necessidade de se efectuarem estudos adicionais, com maior número de amostras e também em estirpes de subtipos não B.
To enter into the human cells, the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) gp120 envelope glycoprotein interacts with the cellular receptor CD4 and one of two main coreceptors, CCR5 and CXCR4. Coreceptor usage determines the tropism of the virus for the target cells. CCR5-using viruses are classified as R5 variants, CXCR4-using viruses are classified as X4 variants, and viruses that use both coreceptors are classified as dual/mixed R5X4. CCR5 coreceptor antagonists are a new drug class, which specifically blocks the CCR5 coreceptor. Recently Maraviroc was approved for clinical use as the first agent of this class. Because of its exclusive activity against CCR5 tropic variants, viral tropism testing is mandatory before using Maraviroc in the clinical practice. Currently HIV-1 coreceptor usage is determined by phenotypic assays which only one, Trofile HIV Co-receptor Tropism (Monogram Biosciences, USA), has been clinically validated for determination of coreceptor use. This test is time-consuming, with a complex logistics (failures in the proper processing and handling of a sample generally means a no-result), costly and only available in a highly qualified laboratory in the United States. Genotypic approaches have been developed based on HIV-1 env sequences, which have great potential because they are easier, faster and cheaper than phenotypic assays. These methodologies are based on the principle that the variable region (V3) of HIV-1 env gene is a major determinant of coreceptor usage, since it is the region of the virus, which binds to the coreceptor. Several bioinformatics methods have been developed for tropism testing, and some of them are available as online tools: WetCat, Position-specific scoring matrices (WebPSSM) and Geno2pheno [coreceptor]. The predictive value of these algorithms continues to improve as more paired genotypes/phenotypes become available, making the determination of coreceptor use by genotypic assays, more exact.The aim of this study was to validate a genotypic assay for tropism testing based on V3 sequencing, to be applied in clinical practice; - Investigate the evolution of viral tropism at seroconversion and at later stages of disease; - Find out if there are subtype-specific differences in coreceptor usage. One hundred ninety two plasma samples of HIV-1 seropositive individuals were tested. Of these, 119 samples were amplified by nested RT-PCR originating a 534-bp-product corresponding to the C2-V3 region of env gene. Sequences generated by direct sequencing of PCR products were submitted to Geno2pheno algorithm for determination of coreceptor usage. Of the 119 samples, 92 (77,3%) were identified as R5 and 27 (22,7%) as X4 by Geno2pheno. Twenty nine of the 119 samples were tested at the same time for validation of the genotypic assay against Trofile. The phenotypic assay could be successfully performed for 23 (79,3%) specimens, while results using Geno2pheno could be obtained from 28 (96,5%) specimens. The overall concordance between the results obtained using both assays was 87%, with the Geno2pheno standard false positive rate of 10%. In summary, the genotypic and phenotypic assays tested here generated large concordant results and revealed a great prevalence of R5 variants. Against what should be expected, there was no evidence of different use of coreceptors at seroconversion or at final stages of disease. No differences were observed in viral tropism for subtypes B and C. This may be due to the small number of tested samples. Further larger studies are required including non B subtypes.
URI: http://hdl.handle.net/10400.14/8464
Aparece nas colecções:R - Dissertações de Mestrado / Master Dissertations
ICS(P) - Dissertações de Mestrado / Master Dissertations

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