Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.14/16364
Título: Development of a protocol for the detection of Listeria monocytogenes in food using culture enrichement combined with PCR
Autor: Regado, Mafalda Sofia Almeida
Orientador: Teixeira, Paula
Silva, Joana
Data de Defesa: 2010
Resumo: Hoje em dia, os laboratórios de análises alimentares enfrentam algumas dificuldades em atingir com sucesso as necessidades dos seus clientes, em termos de custos e especificidade da análise assim como ultrapassar os longos tempos de resposta para saída de um resultado na detecção e enumeração de alguns organismos patogénios, especialmente no caso de Listeria monocytogenes. L. monocytogenes pode ser encontrada numa grande variedade de alimentos frescos e preparados, e tem sido associada a alguns surtos de infecções alimentares reportados por todo o mundo. Deste modo, este microrganismo é considerado um patogénio emergente de grande importância, também devido à crescente taxa de mortalidade verificada, especialmente entre recém-nascidos, indivíduos imunocomprometidos e idosos. Os protocolos recomendados pela International Standard Organization (ISO) para a detecção de L. monocytogenes, envolvem passos iniciais de enriquecimento e posteriores inoculações em meios selectivos e diferenciais, seguido de confirmações por testes serológicos e bioquímicos. Consequentemente, mais de cinco dias são necessários para confirmar um resultado negativo e sete a dez dias para confirmar um resultado positivo. Por outro lado, os métodos moleculares, como Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR), e outras tecnologias já validadas, como o caso do VIDAS (imunoensaio enzimático), apresentam soluções mais rápidas, sensíveis, específicas e com grande potencial para o processamento de um grande número de amostras, essencial na análise deste patogénio. Deste modo, o uso destas tecnologias nos laboratórios clínicos e na indústria alimentar têm aumentado por todo o mundo. Este estudo teve como objectivo desenvolver um método alternativo para a detecção e identificação de L. monocytogenes que ofereça condições de análise semelhantes ou superiores face aos métodos validados já existentes para a sua detecção. O método desenvolvido combina a tecnologia PCR, pela amplificação de um gene específico de L. monocytogenes (listeriolysin O, hly), com os métodos convencionais já existentes. Assim, foram testadas diferentes tempos de pré-enriquecimento, assim como diferentes métodos de extracção de ADN e condições de PCR, de modo a obter um método alternativo que possa ser mais competitivo face aos já disponíveis no mercado. Foi possível detectar L. monocytogenes em leite, com um método de extracção de ADN optimizado, mais económico e rápido, assim como confirmar um resultado positivo ou negativo em menos de 48 h, reduzindo o tempo de pré-enriquecimento em ½ Fraser, de 24 para 12 h. Contudo, o método desenvolvido deverá ser optimizado, tendo em vista a obtenção de uma sensibilidade superior a ~103 CFU/mL, para culturas puras e no alimento estudado.
Nowadays, food analytical laboratories have difficulty in achieving the needs of their costumers in terms of turnaround time to results, combined with specificity and low cost analysis for the detection/enumeration of numerous microorganisms, especially in the case of Listeria monocytogenes. L. monocytogenes can be found in a wide variety of raw and processed foods, which have been implicated in several outbreaks of listeriosis world-wide. Therefore this microorganism has been considered an emergent pathogen, with a high case-fatality rate, especially among neonates, immune-compromised individuals and elderly people. According to the recommended standard protocols, the detection of L. monocytogenes involves initial enrichment and subsequent culturing steps on selective media, followed by serological and/or biochemical confirmation tests. Thereby, at least five days are needed to confirm a negative result and seven to ten days to confirm a positive result. On the other hand, molecular methods like Polymerase Chain Reaction (PCR)-based technologies and other validated alternative methods, such as VIDAS technology, are rapid, sensitive, specific and have the potential for high sample throughput, which is essential to pathogen detection in food analysis. Consequently, the use of these technologies by the food industries and clinical laboratories has been increasing world-wide. The present study aimed to develop an alternative method for the detection and identification of L. monocytogenes with a similar or even better performance than the validated methods already available for detection of this pathogen. The method developed combines PCR technology, by amplification of a specific gene (listeriolysin O, hly) of L. monocytogenes, with what is already being performed in the conventional standard protocols. Different incubation periods were tested in selective enrichment media, as well as different DNA extraction protocols and PCR conditions in order to obtain an alternative method which could be competitive with those already available for industry and consultant laboratories. It was possible to detect L. monocytogenes in milk, with an optimized DNA extraction method which was less expensive in terms of consumables, and with a lower turnaround time. It was also possible to confirm a positive and negative result in less than 48h, by reducing the pre-incubation period in ½ Fraser broth from 24 to 12 h. Results obtained showed that this procedure still needs to be optimized to have better performance to the one obtained, ~103 CFU/mL in the pure cultures and food matrix studied.
URI: http://hdl.handle.net/10400.14/16364
Aparece nas colecções:ESB - Dissertações de Mestrado / Master Dissertations
R - Dissertações de Mestrado / Master Dissertations

Ficheiros deste registo:
Ficheiro Descrição TamanhoFormato 
Temporario.pdf9,29 kBAdobe PDFVer/Abrir


FacebookTwitterDeliciousLinkedInDiggGoogle BookmarksMySpace
Formato BibTex MendeleyEndnote Degois 

Todos os registos no repositório estão protegidos por leis de copyright, com todos os direitos reservados.