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Título: Membrane-active peptides from structural viral proteins : identifying novel delivery vectors for gene therapy
Autor: Flores, Luís Rafael Pereira do Carmo
Orientador: Castanho, Miguel Augusto Rico Botas
Palavras-chave: Proteínas Estruturais de Vírus
Péptidos Translocadores de Membranas
Administração Controlada de Fármacos
Terapia Génica
Péptidos Activos em Membranas
Bioquímica Física
Structural Viral Proteins
Cell-penetrating Peptides
Drug Delivery
Gene Therapy
Membrane-active Peptides
Physical Biochemistry
Data de Defesa: 27-Mar-2014
Resumo: Péptidos activos em membranas são relevantes em diversos campos da biomedicina. Os péptidos translocadores de membranas (CPPs), em particular, são promissores na administração de fármacos, incluindo em terapia génica. O presente trabalho teve por objectivo identificar novas sequências CPPs em proteínas estruturais de vírus utilizando técnicas bioinformáticas e validação experimental. 270 proteínas virais foram examinadas para reconhecimento de potenciais CPPs, tendo sido identificadas 2400 sequências putativas. 14 CPPs de vírus foram seleccionados para ensaios in vitro como vectores para carga génica, utilizando oligonucleótidos de ssDNA como modelo. A eficiência de entrega foi monitorizada por espectroscopia de fluorescência, citometria de fluxo e microscopia confocal. Adicionalmente, efectuaram-se ensaios biofísicos para compreender propriedades físico-químicas necessárias para entrega celular eficiente dos CPPs. Consequentemente, medidas de potencial de membrana com di-8-ANEPPS foram utilizados ao estudar afinidade de CPPs para membranas. Foi usado dicroísmo circular para inferir estruturas secundárias induzidas em CPPs por membranas lipídicas. A conjugação entre CPPs de vírus e oligonucleótidos foi também avaliada por dispersão dinâmica de luz para aferir a formação de complexos entre vectores e carga transportada. Seis dos péptidos demonstraram eficiência na entrega de ssDNA a células. Dados biofísicos demonstraram que a eficiência da entrega de CPPs está dependente das interacções entre CPPs e lípidos, assim como da capacidade de conjugação com a carga a transportar. Dois CPPs foram particularmente eficientes e deverão continuar sob desenvolvimento e caracterização. Proteínas estruturais de vírus são uma fonte viável de CPPs, e podem ser exploradas para outras biotecnologias de péptidos activos em membranas, nomeadamente péptidos antimicrobianos.
Membrane-active peptides provide wide therapeutic potential in several biomedical areas. Among these, cell-penetrating peptides (CPPs) are highly promising molecules in drug delivery, particularly when applied to gene therapy applications. This work aimed to identify novel CPP sequences in structural viral proteins using bioinformatics, followed by experimental validation. 270 structural viral proteins were screened for the existence of potential CPP sequences, which resulted in the identification of 2400 putative sequences. A subset of 14 viral CPPs was selected for in vitro testing as gene cargo vectors using a 15-mer ssDNA oligonucleotide as a model. Delivery efficiency was monitored by fluorescence spectroscopy, flow cytometry and confocal microscopy. Furthermore, biophysical assays were conducted to understand the physical-chemical properties required for effective CPP cellular delivery. As such, membrane dipole potential sensing, using di-8-ANEPPS, was employed to study the affinity of CPPs towards lipid membranes. Circular dichroism was used to infer about lipid membrane-induced CPP secondary structure. Moreover, conjugation between each viral CPP and oligonucleotides was evaluated by dynamic light scattering to infer about the proper formation of vector:cargo complexes. Six peptides demonstrated clear efficiency in delivering ssDNA into cells. Biophysical data showed that the molecular determinants required for an efficient CPP are dependent on CPP-lipid interactions and proper conjugation with the cargo to deliver. Thus, two CPPs were particularly efficient and should be considered for future development and characterization. Structural viral proteins are a viable source for new CPPs, which may also be explored for other membrane-active peptide biotechnologies, namely antimicrobial peptides.
URI: http://hdl.handle.net/10400.14/15011
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