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dc.contributor.advisorCastro, Paula Maria Lima-
dc.contributor.advisorTiritan, Maria Elizabeth-
dc.contributor.advisorAfonso, Carlos Manuel Magalhães-
dc.contributor.authorRibeiro, Ana Rita Lado Teixeira-
dc.date.accessioned2014-04-01T14:59:37Z-
dc.date.available2014-04-01T14:59:37Z-
dc.date.issued2014-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10400.14/13912-
dc.description.abstractThe importance of the stereochemistry in medicinal chemistry and in pharmacology is well recognized and the diverse behaviour of enantiomers in the presence of chiral entities is fully documented. Therefore biodegradation in biotic media, as occurs in secondary treatment of wastewater treatment plants (WWTPs) can be enantioselective. The significance of chirality in the environment is comparable to the magnitude in medicinal chemistry and pharmacology since enantiomers of chiral contaminants can significantly differ in environmental fate as well as in effects. The need to evaluate the occurrence and biodegradation processes of single enantiomers of chiral pharmaceuticals (CPs) in the environment is imperative by enantiomeric fraction (EF) monitoring of biodegradation processes, wastewaters and surface waters. Assessing EF is only possible through enantioselective validated methods, which are currently scarce. The work described in this thesis comprises the development of new enantioselective analytical methodologies to accurately measure the EFs of CPs in environmental matrices and/or during biodegradation processes, especially for application to monitoring studies and designed biodegradation. The enantioselective analytical methods developed allowed the studies of biodegradation of several CPs in mineral growth medium (MM) inoculated with activated sludge; with the bacterial strain Labrys portucalensis F11; and in wastewater effluents. Additionally an enantioselective method for EFs quantification of multi-residue CPs was developed to monitor effluents of WWTPs and laboratory-scale bioreactors. Thus, this thesis allows increasing the knowledge on EF variation during biodegradation studies and also in environmental matrices. A vancomycin-based chiral stationary phase ChirobioticTM V column (4.6 mm internal diameter (i.d.)) was used to develop and validate two enantioselective analytical methods by High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detector (HPLC-FD), allowing the analysis of enantiomers of alprenolol (ALP), atenolol (ATE), metoprolol (MET), propranolol (PHO) and fluoxetine (FLX) in biodegradation assays using MM inoculated with activated sludge. Biodegradation of the racemic mixtures was assessed in MM inoculated with activated sludge. The developed HPLC-FD methods under polar ionic mode had several advantages such as a simple sample preparation method; short chromatographic run; low flow rate; no need of solvents for sample preparation or derivatization and the use of an easy to operate, selective and sensitive detector. Biodegradation by activated sludge had slightly higher rates for the (S)-enantiomeric forms of ALP, PHO and MET, with the enhanced biodegradation by acetate as another growth substrate. Biodegradation of ATE and FLX was non-enantioselective. The effect of simultaneous supplementation decreased the biodegradation rates of all enantiomers perhaps due to a competitive mechanism. An enantioselective analytical method by HPLC-FD was optimized and validated using the ChirobioticTM V column (4.6 mm i.d.) to analyse individual enantiomers of FLX and the metabolite norfluoxetine (NFLX). This method preconcetrated 50 mL of wastewater samples through solid phase extraction (SPE) with Oasis® Mixed mode Cation eXchange (MCX) cartridges and allowed the simultaneous analysis of FLX and NFLX enantiomers under reversed mode using an eco-friendly mobile phase constituted by ethanol and ammonium acetate buffer. The method demonstrated to be easy to operate, selective, sensitive and easy to adapt to other matrices. Biodegradation of racemic FLX in microcosms mimicking aquatic environments (WWTP effluents) was followed by the validated method during 46 days with no observation of enantioselectivity in degradation process. The biodegradation of each enantiomer of FLX separately was also evaluated in MM inoculated by the bacterial strain Labrys portucalensis F11. Degradation of the two enantiomers with preferential degradation of the (R)-enantiomer was observed, with no observation of enantiomerization during the monitorization. The metabolite NFLX was not detected during degradation. An enantioselective SPE-HPLC with tandem Mass Spectrometry method was developed with a triple quadrupole mass analyser using the ChirobioticTM V column with 2.1 mm i.d. in reversed mode to quantify enantiomers of seven CPs belonging to different therapeutic classes (ALP, bisoprolol (BSP), MET, PHO, FLX, venlafaxine (VNF) and salbutamol (SBT)) and one metabolite (NFLX). This method used effluent of a laboratory-scale bioreactor for matrix validation and Oasis® MCX cartridges to preconcentrate 250 mL of water samples, being useful for monitoring wastewater effluents and also effluents of laboratory-scale bioreactors. The limits of detection were between 0.65 and 11.5 ng L-1. The use of a selective and sensitive detector allowed the unequivocal identification and quantification of the target enantiomers in complex matrices. The effluents of three municipal WWTPs in Portugal were analysed. Enantiomers of FLX, VNF, BSP, MET and PHO were found. VNF and FLX were found with EFs different from 0.5.por
dc.description.abstractA importância da estereoquímica em química medicinal e farmacologia é reconhecida e o diferente comportamento de enantiómeros face a entidades quirais está bem documentado. Assim, a biodegradação em meios biológicos como acontece no tratamento secundário das estações de tratamento de águas residuais (ETAR), pode ser enantiosseletiva. A importância da quiralidade no ambiente é comparável à química medicinal e farmacologia, uma vez que enantiómeros de contaminantes quirais podem diferir significativamente no seu destino no ambiente, assim como nos seus efeitos. A necessidade de avaliar a ocorrência e os processos de biodegradação de enantiómeros de fármacos quirais (FQ) no ambiente é imperativa, através da monitorização da fração enantiomérica (FE) na biodegradação, em águas residuais e superficiais. A avaliação da FE só é possível através de métodos enantiosseletivos validados, atualmente escassos. O trabalho descrito nesta tese envolve o desenvolvimento de novas metodologias analíticas enantiosseletivas para aferir corretamente a FE dos FQ em matrizes ambientais e/ou em processos de biodegradação, especialmente para aplicação em estudos de biodegradação e monitorização. Os métodos enantiosseletivos desenvolvidos permitiram acompanhar a biodegradação de vários FQ num meio de crescimento mineral (MM) inoculado com lamas ativadas; com a estirpe bacteriana Labrys portucalensis F11; e em efluentes de águas residuais. Adicionalmente, um método enantiosselectivo para a quantificação multiclasse da FE de FQ foi desenvolvido para monitorizar efluentes de ETAR e de bioreatores à escala laboratorial. Assim, esta tese permite melhorar o conhecimento da variação da FE em estudos de biodegradação e também em matrizes ambientais. Uma fase estacionária quiral baseada em vancomicina, a coluna ChirobioticTM V (4.6 mm diâmetro interno (d.i.)), foi usada para desenvolver e validar dois métodos analíticos enantiosseletivos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detetor de Fluorescência (HPLC-FD), para a análise dos enantiómeros do alprenolol (ALP), atenolol (ATE), metoprolol (MET), propranolol (PHO) e fluoxetina (FLX) em ensaios de biodegradação em MM inoculado com lamas ativadas. Os métodos de HPLC-FD desenvolvidos em modo polar iónico tiveram vantagens como: simples preparação de amostra; curto tempo de eluição cromatográfica; ausência de derivatização e de solventes orgânicos na preparação de amostra; e o uso de um detetor sensível, seletivo e fácil de operar. A biodegradação por lamas ativadas teve taxas ligeiramente superiores para as formas (S)-enantioméricas do ALP, PHO e MET, com a biodegradação promovida pelo acetato, usado como substrato adicional de crescimento. A biodegradação do ATE e da FLX foi não-enantiosseletiva. O efeito da suplementação simultânea diminuiu as taxas de biodegradação de todos os enantiómeros, possivelmente devido a um mecanismo de competição. Um método analítico enantiosseletivo por HPLC-FD foi otimizado e validado usando a coluna ChirobioticTM V (4.6 mm d.i.) para analisar os enantiómeros da FLX e do metabolito norfluoxetina (NFLX). Este método preconcentrou 50 mL de amostra de águas residuais por extração em fase sólida (SPE)-HPLC-FD com cartuxos Oasis® Mixed mode Cation eXchange (MCX) e permitiu a análise simultânea dos enantiómeros da FLX e NFLX no modo reverso, usando uma fase móvel amiga do ambiente constituída por etanol e tampão acetato de amónio. O método demonstrou ser sensível, seletivo, fácil de operar e facilmente adaptável a outras matrizes. A biodegradação da FLX racémica em microcosmos simulando ambientes aquáticos (efluentes de ETAR) foi seguida pelo método validado durante 46 dias, não se observando enantiosseletividade no processo de degradação. A biodegradação de cada enantiómero da FLX separadamente foi também avaliada em MM inoculado com a estirpe bacteriana Labrys portucalensis F11. Ambos foram degradados, com degradação preferencial do (R)-enantiómero, não se observando enantiomerização durante a monitorização. O metabolito NFLX não foi detetado durante a degradação. Um método enantiosseletivo SPE-HPLC com um analisador de massa triplo quadrupolo foi desenvolvido, utilizando a coluna ChirobioticTM V com 2.1 mm d.i. no modo reverso, para quantificar enantiómeros de sete FQ pertencentes a diferentes classes terapêuticas (ALP, bisoprolol (BSP), MET, PHO, FLX, venlafaxina (VNF) e salbutamol (SBT)) e um metabolito (NFLX). Este método utilizou efluente de um bioreator laboratorial para a validação em matriz e cartuxos Oasis® MCX para preconcentrar 250 mL de amostra de água. Este método pode ser utilizado na monitorização de efluentes de ETAR e de bioreatores. Os limites de deteção do método encontraram-se entre 0.65 e 11.5 ng L-1. O uso de um detetor seletivo e sensível permitiu a identificação inequívoca e a quantificação dos enantiómeros alvo em matrizes complexas. Efluentes de três ETAR municipais em Portugal foram analisados. Enantiómeros da FLX, VNF, BSP, MET e PHO foram detetados. A VNF e a FLX foram encontradas com FE diferentes de 0.5.por
dc.language.isoengpor
dc.rightsembargoedAccesspor
dc.titleChiral pharmaceuticals in the environment : enantiomeric fraction and biodegradation studiespor
dc.typedoctoralThesispor
dc.date.embargo2050-12-31-
dc.identifier.tid101316100-
dc.subject.fosDomínio/Área Científica::Ciências Médicas-
Aparece nas colecções:R - Teses de Doutoramento / Doctoral Theses
ESB - Teses de Doutoramento / Doctoral Theses



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