Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.14/13257
Título: Selection of an antimicrobial culture to be used in the prevention of neonatal listeriosis
Autor: Borges, Sandra Cristina Ferreira
Orientador: Teixeira, Paula Cristina Maia
Silva, Joana Gabriela Laranjeira
Data de Defesa: 2013
Resumo: The capacity of lactic acid bacteria to produce acidic products and/or secrete antimicrobial compounds is important in the impairment of vaginal colonization by pathogens. Vaginal pH is normally acidic, varying between 3.5-4.5; an increase in vaginal pH (5.0 to 6.5) can be associated with colonization by pathogenic microorganisms. The main goal of this study was to select an antimicrobial culture to be used in the prevention of vaginal colonization of Listeria monocytogenes during pregnancy, and consequently, prevent neonatal listeriosis. The survival and biofilm formation of 20 isolates of L. monocytogenes in simulated vaginal fluid at normal vaginal pH (4.2) and at higher pH values (5.5 and 6.5) was investigated. This pathogen was inhibited by the normal vaginal pH but survives when pH increases. All isolates tested were biofilm producers at different pH values. Streptococcus agalactiae is an important cause of neonatal infection and maternal colonization. Therefore, its behavior in simulated vaginal fluid was also analyzed. As with L. monocytogenes, S. agalactiae (n=10) survived longer at higher pH values than at normal vaginal pH. All S. agalactiae isolates were also biofilm producers. Therefore, since L. monocytogenes and S. agalactiae can survive at higher vaginal pHs, fetuses/neonates from women having increased vaginal pH values during pregnancy, may be at higher risk of neonatal infection. Biofilm production increases the probability of occurrence of neonatal infection. The application of vaginal probiotics could have the potential for preventing vaginal Listeria colonization in pregnant women and consequently reduce neonatal infections. Thirty-five isolates of Pediococcus spp. showed antimicrobial activity against L. monocytogenes, by production of a bacteriocin, but did not inhibit S. agalactiae isolates. Pediococcus spp. isolates demonstrated the ability to survive in simulated vaginal fluid at pH 4.2. Based on the higher bacteriocinogenic activity and survival in simulated vaginal fluid, one isolate of Pediococcus spp. was selected and characterized to evaluate its safety before use as vaginal probiotic. Pediococcus pentosaceus SB83 did not show the presence of virulence factors such as the production of gelatinase, lipase and DNase, hemolytic activity, nor the presence of virulence genes (i.e. surface adhesin, aggregation protein, cytolysin and extracellular metallo-endopeptidase). No relevant antibiotic resistance traits were detected. Pediococcus pentosaceus SB83 produced biofilms at different pH values (4.2, 5.5 and 6.5) in simulated vaginal fluid, which could also serve as a protective layer against colonization by pathogenic bacteria. The bacteriocin produced by P. pentosaceus SB83, designated as bacteriocin SB83, also showed inhibitory activity against Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium, but did not inhibit vaginal lactic acid bacteria. Bacteriocin SB83 is resistant to several conditions, including conditions in the vaginal tract (pH and components of vaginal fluid). The bacteriocinogenic activity of P. pentosaceus SB83 against L. monocytogenes was evaluated in simulated vaginal fluid at pH 6.5, since this is the ideal pH to the L. monocytogenes survival and proliferation. There the inhibitory effect of the bacteriocinogenic culture was assessed in suspension, as lyophilized powder and in tablets. Suspensions of P. pentosaceus SB83 (1010 CFU/mL) reduced the pathogen (10 CFU/mL) 5after only 2 h of exposure to below the detection limit; the lyophilized bacteria after 24 h of contact and in tablet form, P. pentosaceus SB83 lost the antimicrobial activity. The pH of simulated vaginal fluid decreased in all the tested conditions. Since P. pentosaceus SB83 lose its antimicrobial activity in tablet form, it could be therefore used in the form of lyophilized powder, which may be administered intra-vaginally, for instance as a washing solution. This formulation was selected to evaluate the anti-listerial activity during 12 months of storage. During storage at room temperature, lyophilized bacteria totally inhibited the pathogen (below the detection limit) only during one month; after this time, there was a decrease in the cell counts of P.pentosaceus SB83 and, consequently, in antimicrobial potential. During storage at 4 ºC, P. pentosaceus SB83 showed antimicrobial activity throughout the time of storage investigated. The bacteriocin produced by P. pentosaceus SB83 after storage at 4 ºC, remained active at least during 12 months, however a slight decrease in antimicrobial activity occurred between 9 to 12 months. Therefore, the best formulation of P. pentosaceus SB83 is as a lyophilized powder stored at 4 ºC. These in vitro results prove a concept for the use of P. pentosaceus SB83 as a vaginal probiotic, to prevent vaginal colonization by L. monocytogenes in pregnant women.
Os compostos antimicrobianos produzidos pelas bactérias do ácido láctico são importantes para a diminuição da colonização vaginal por agentes patogénicos. O pH vaginal é normalmente acídico, variando entre 3,5-4,5; um aumento do pH vaginal (5,0 a 6,5) pode ser associado à colonização por microrganismos patogénicos. O objetivo principal deste estudo foi selecionar uma cultura com propriedades antimicrobianas com potencial para utilização na prevenção da colonização vaginal por Listeria monocytogenes durante a gravidez e, consequentemente, evitar a listeriose neonatal. Foi investigada a sobrevivência e a capacidade de formação de biofilmes para 20 isolados de L. monocytogenes em fluido vaginal simulado a pH vaginal normal (4,2) e a valores de pH elevados (5,5 e 6,5). Este patogénico foi inibido em condições de pH vaginal normal, mas sobreviveu quando este aumentou. Todos os isolados testados formaram biofilme aos diferentes valores de pH. Streptococcus agalactiae, é um importante agente de colonização maternal e causa de infeção neonatal. Por este motivo, foi também analisado o seu comportamento em condições de simulação de fluido vaginal. Tal como L. monocytogenes, os isolados de S. agalactiae (n=10) sobreviveram melhor a valores de pH elevados comparativamente ao pH vaginal normal. Todos os isolados foram também produtores de biofilme. O facto de L. monocytogenes e S. agalactiae sobreviverem a valores de pH vaginal elevados, sugere que as mulheres grávidas que tenham um aumento do pH vaginal, podem ter um maior risco de infeção neonatal. A produção de biofilmes aumenta a probabilidade de ocorrência destas infeções. A aplicação vaginal de probióticos apresenta potencial para a prevenção de colonização vaginal por L. monocytogenes em mulheres grávidas e, consequentemente, reduzir as infeções neonatais. Trinta e cinco isolados de Pediococcus spp., demonstraram atividade antimicrobiana contra L. monocytogenes, pela produção de uma bacteriocina, no entanto, não apresentou atividade contra os isolados de S. agalactiae. Estes isolados de Pediococcus spp. sobreviveram no fluido vaginal simulado a pH 4,2. Com base nos resultados da avaliação da atividade bacteriocinogénica e sobrevivência em fluido vaginal simulado, Pediococcus pentosaceus SB83 foi selecionado para futura aplicação como probiótico vaginal. Pediococcus pentosaceus SB83 não demonstrou possuir fatores de virulência tais como produção de gelatinase, lipase e DNase, atividade hemolítica, nem possuiu os genes de virulência estudados (adesina de superfície, proteína de agregação, citolisina e metalo-endopeptidase extracelular). Não foram detetadas resistências a antibióticos. Pediococcus pentosaceus SB83 demonstrou ser produtor de biofilme em fluido vaginal simulado a diferentes valores de pH (4,2, 5,5 e 6,5), que também pode atuar como camada protetora contra a colonização por bactérias patogénicas. A bacteriocina produzida por P. pentosaceus SB83, designada por bacteriocina SB83, também demonstrou atividade inibitória contra Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium, mas não apresentou efeito inibitório para bactérias do ácido láctico autóctones do trato vaginal. A bacteriocina SB83 demonstrou ser resistente a vários parâmetros, incluindo as condições do trato vaginal (pH e componentes do fluido vaginal). A atividade bacteriocinogénica de P. pentosaceus SB83 contra L. monocytogenes foi avaliada em fluido vaginal simulado a pH 6,5, pois este demonstrou ser o pH ideal para a sobrevivência e proliferação de L. monocytogenes. Foi testado o efeito inibitório da cultura bacteriocinogénica em suspensão, na forma liofilizada e em comprimidos. A suspensão bacteriana de P. pentosaceus SB83 (1010 UFC/mL) reduziu o patogénico (10 UFC/mL) em5 apenas 2 h (abaixo do limite de deteção), a bactéria liofilizada após 24 h de contacto e em comprimidos o P. pentosaceus SB83 perdeu a atividade antimicrobiana. O pH do fluido vaginal simulado diminuiu para todas as condições testadas. Como P. pentosaceus SB83 perdeu a atividade antimicrobiana quando na forma de comprimido, poderá ser utilizado na forma liofilizada, a qual pode ser administrada intravaginalmente, por exemplo como uma solução de lavagem. Esta formulação foi a selecionada para avaliar a atividade anti-listerial durante 12 meses de armazenamento. Durante o armazenamento à temperatura ambiente, a bactéria liofilizada inibiu totalmente o patogénico (abaixo do limite de detecção) apenas durante um mês; após este período de tempo, houve uma diminuição SB83 e, consequentemente, o potencial antimicrobiano. Durante o armazenamento a 4 ºC, P. pentosaceus SB83 apresentou atividade antimicrobiana durante todo o tempo de armazenamento investigado. A bacteriocina produzida por P. pentosaceus SB83 após o armazenamento a 4 ºC, manteve-se ativa pelo menos durante 12 meses, no entanto, uma ligeira diminuição na atividade antimicrobiana ocorreu entre os 9 e 12 meses. Portanto, a melhor formulação de P. pentosaceus SB83 é como liofilizado armazenado a 4 ºC. Estes resultados in vitro provam o conceito para a utilização de P. pentosaceus SB83 como probiótico vaginal, para prevenir a colonização vaginal por L. monocytogenes em mulheres grávidas.
URI: http://hdl.handle.net/10400.14/13257
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ESB - Teses de Doutoramento / Doctoral Theses

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