Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.14/10505
Título: Instabilidade cromossómica induzida pelo diepoxibutano (DEB) em fibroblasticos cutâneos para diagnóstico da anemia de Fanconi
Autor: Leite, Maria de Fátima de Sousa
Orientador: Porto, Beatriz
Data de Defesa: Set-2012
Resumo: A anemia de Fanconi (AF) é uma doença rara, de transmissão autossómica recessiva ou ligada ao X, geneticamente e fenotipicamente heterogénea, caracterizada por instabilidade cromossómica (IC), falência da medula óssea e predisposição para o cancro. A doença manifesta-se quando existem mutações em qualquer um dos 15 genes já identificados. A sua variabilidade fenotípica dificulta o diagnóstico com base nas características clínicas, sendo necessário a realização de testes laboratoriais para sua confirmação, como seja, a deteção de IC induzida por diepoxibutano (DEB) em culturas de linfócitos de sangue periférico (SP). A quantificação, por citometria de fluxo (CF), da percentagem de células acumuladas nas fases G2/M do ciclo celular, foi apontada como um método complementar de diagnóstico. No entanto, estes testes podem não ser sensíveis para os casos de mosaicismo, ou seja, nas situações em que há reversão das células hematopoiéticas com mutação AF, para um fenótipo normal. Nestas situações, devem então ser feitos esses mesmos testes em culturas de fibroblastos, onde não existe reversão, procedimentos laboratoriais que até ao momento não estavam disponíveis no Laboratório de Citogenética do Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto (ICBAS/UP). Assim, os objetivos deste trabalho foram a caracterização da população de pacientes com AF, estudada no Laboratório de Citogenética do ICBAS/UP, relativamente à frequência de mosaicismo, e a implementação da técnica de cultura de fibroblastos, seguida de estudos de IC e do ciclo celular, realizada com a colaboração do Laboratório de Citometria do Serviço de Hematologia Clínica do Hospital de Santo António, Centro Hospitalar do Porto. Dos 233 pacientes avaliados para IC no SP, 39 foram diagnosticados como pacientes com AF, e destes 13% foram caracterizados como mosaicos, valor este, que por si só já justifica a importância de implementar a técnica de análise da IC em fibroblastos. Esta foi implementada a partir de amostras de fibroblastos cutâneos de 6 indivíduos saudáveis e 2 pacientes enviados para exclusão de AF, em que não foi confirmado este diagnóstico. Os resultados obtidos nos fibroblastos, tanto para a IC induzida por DEB como para a acumulação de células em G2/M, estudada por CF, estão de acordo com os resultados descritos na literatura para controlos e pacientes não AF. Conseguiu-se então implementar, pela primeira vez e com sucesso, o protocolo de cultura de fibroblastos e o protocolo de análise do ciclo celular dos fibroblastos por CF. Contudo, o sucesso total do protocolo para o diagnóstico de AF requer ainda confirmação em amostras de fibroblastos de pacientes com AF, as quais não foram possíveis obter durante o período de execução deste trabalho, uma vez que se trata de uma doença rara.
Fanconi anemia (FA) is a rare genetic disease, autosomal recessive or X-linked, genetically and phenotypically heterogeneous, characterized by chromosomal instability (CI), bone marrow failure, and predisposition to cancer. The FA is caused by mutations in any one of 15 known genes. Diagnosis based on clinical manifestations can be difficult because of the phenotypic variability, and laboratory tests may be necessary to confirm it, such as the detection of CI induced by diepoxybutane (DEB) in peripheral blood (PB) lymphocyte cultures. In addition, flow cytometry (FC) based quantification of the percentage of cells accumulated at the phase G2 / M of cell cycle, was also described as a complementary test for the diagnosis of FA. However, these tests are not sensitive for the study of mosaicism, a situation where reversion of the AF mutation to a normal phenotype occurs in hematopoietic cells. In those situations the same tests may be performed in fibroblast cultures, where there is no reversion. Nevertheless, these laboratorial procedures were not yet available in the Laboratory of Cytogenetics of the Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto (ICBAS/UP), a reference lab for the study of FA. Therefore, the objectives of the present work were the characterization of the FA population previously studied in this laboratory concerning the percentage of mosaicism, and the implementation of the technique for fibroblast cultures followed by CI detection and study of progression of the cell cycle to G2/M, by FC. Flow cytometry studies were performed in collaboration with the Laboratory of Cytometry from the Haematology Department of Hospital de Santo António, Centro Hospitalar do Porto. Of the 233 patients studied for CI in the PB, 39 were diagnosed as FA and 13% of them as mosaics. This value, per se, justifies the importance of the implementation of the techniques for analysis of CI and cell cycle in fibroblasts. Therefore, implementation was achieved using cutaneous fibroblast samples from 6 normal individuals and 2 patients enrolled for exclusion of FA, in which the diagnosis was not confirmed. The results obtained in the fibroblasts, both for DEB-induced CI and G2/M arrest, are in agreement with results from the literature for controls and non FA patients. In conclusion, it was possible to implement for the first time and successfully the protocol for fibroblast cultures followed by DEB-induced CI analysis and cell cycle analysis by FC. However, the full success of the protocols still requires confirmation with samples of fibroblasts from FA patients. Unfortunately, it was not possible to get those samples during the period of execution of the present work, due to the rarity of the disease.
URI: http://hdl.handle.net/10400.14/10505
Aparece nas colecções:R - Dissertações de Mestrado / Master Dissertations
ICS(P) - Dissertações de Mestrado / Master Dissertations

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